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研究背景钙离子是一种细胞内重要的电荷载流子,同时作为一种普遍的介质参与各种细胞过程。在心肌细胞里,这些过程包括基因转录、兴奋-收缩耦联及凋亡。众所周知,细胞内钙离子传递电信号到机械活动,造成单个心肌细胞的短缩进而整个心脏的收缩。然而,近期的研究结果越来越多的证据显示细胞内钙超载会导致许多心脏疾病,如心肌病、心功能不全和心律失常。钙/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它可以磷酸化细胞内的许多种蛋白,从而使得细胞内的钙离子浓度提高。CaMKⅡ在正常的心肌细胞以及病理状态下的心肌细胞里的钙循环都起着重要的调控作用。而且,近期证实,CaMKⅡ有可能成为一个针对心脏疾病治疗的潜在药物靶标。许多报道证实在心肌肥厚、心力衰竭和心律失常的病例中,CaMKⅡ的活性增加、表达上调。在心脏疾病中,CaMKⅡ蛋白的含量和活性程度会随着离子通道的高表达而得到激活和提高。CaMKⅡ有四种亚型α、β、γ及δ,其中δ亚型是CaMKⅡ在心脏最主要的表型。心肌细胞的动作电位有一个独特的以平台期为特征的延长的除极电位,它的形成主要是钙离子内流与钾离子外流动态平衡的结果。在很多心脏疾病中心肌细胞的电活动的改变是由于钙信号蛋白的重塑和其它离子通道蛋白的改变而发生的。CaMKⅡ是一种广为人知的调控细胞内钙离子迁移的频率和幅度的蛋白激酶,能被细胞CaMKⅡ内较高浓度的钙离子激活,比如当心率加快时,细胞内钙增加,激活CaMKⅡ,活化后的CaMKⅡ可以磷酸化许多种丝氨酸/苏氨酸钙调控蛋白,诸如L型钙离子通道（LTCC）、软诺丁受体（RyR2）、基质网钙离子受体2a抑制蛋白（PLN）。心肌细胞内CaMKⅡ通过调控细胞内钙离子浓度而改变动作电位的时程,因此,CaMKⅡ被认为可能与增加心律失常的发生机会有关。但其中的机制还在不断探求中。心房纤颤（房颤）是一种临床上最为常见的心律失常,它的发生伴随着血栓栓塞事件的增加和住院率的增加等危害,具有较多的致死率和致残率。心房纤颤发生的潜在电生理机制是快速的异位触发心律和折返机制,而究其发生主要是由于延长的动作电位时程及决定于心肌细胞减慢的电传导和/或缩短的心房肌细胞不应期。临床上,在心房纤颤的患者的心房肌细胞里,发现存在有异常增高的细胞内钙蓄积,并且研究证实心肌细胞内钙超载,在心律失常的发生中起着关键的作用。同时,在房颤患者的心房肌细胞里也发现有CaMKⅡ的异常高表达。最近,更多的研究者在关注CaMKⅡ与各种心律失常的联系机制,但更多的试验正在涉及到确认是否心房纤颤的发生及维持与CaMKⅡ直接相关。给予培养的原代心房肌细胞以快速的电场刺激,被用来模拟在体外心房纤颤的细胞微环境,且电场刺激被证实通过缩短动作电位时程致易于发生房颤使得心房肌发生电重构。但在这一过程中CaMKⅡ的功能及作用还未被明确。我们设想增加心房肌细胞内CaMKⅡδ的表达量会影响到基质网的钙释放以及L型钙通道钙离子内流,而快速的电场刺激模拟增加的心率致细胞内钙短暂增加而激活CaMKⅡδ,从而改变细胞内钙离子稳态,致房颤的发生。本研究通过改变CaMKⅡδ表达量来探索其在电场刺激导致心肌细胞钙变化中的作用,可以为房颤的治疗提供一定的理论基础。实验方法病毒载体构建和病毒制备:大鼠CaMKⅡδ（NM012519）的cDNA从Open Biosystems购买（7939424）。开放阅读框通过PCR的方法连接到慢病毒载体LV-IRES-RFP中,得到质粒LV-CaMKⅡδ-IRES-RFP. CaMKⅡδ通过CMV启动子驱动表达。为了下调CaMKⅡδ表达,我们设计了三对siRNA,并且连入慢病毒载体,此载体中siRNA通过双向启动子表达。所有质粒都通过测序验证。慢病毒颗粒通过将包装质粒和病毒载体共转染293FT细胞获得,粗制的病毒液收集后超速离心可获得滴度108 TU/ml的病毒液,用于后继实验。原代心肌细胞培养和转染:从新生大鼠（1-2天）上快速分离心脏,再将心室分离并用0.125%胰酶和0.1%胶原酶I消化。收集单细胞悬液,按0.5～1×104/cm2的密度接种于6孔板或玻片上。48小时后,按MOI=10加入慢病毒。培养48小时后,将培养基换为新鲜DMEM,继续培养细胞待后继使用。心肌细胞电场刺激:培养的原代心肌细胞置于培养箱内,加上连续电场刺激24小时。电场由计算机控制,电波频率10Hz,电压1.5 V/cm。细胞钙检测:咖啡因刺激的钙流通过扫描共聚焦显微镜进行观察。L型钙离子通道电流通过膜片钳检测。挑选带有红色荧光的心肌细胞进行检测。为了消除细胞大小差异的影响,电流强度定义为电流密度除以细胞电容。结果成功构建了CaMKⅡδ基因的表达慢病毒载体,通过转染293FT细胞制备慢病毒,可以得到高滴度的病毒液,用此病毒转染原代心肌细胞,能够在细胞内获得较好的基因表达。另一方面设计了三条干扰序列,通过转染293FT细胞并用Western blot检测筛选出2#序列具有较好的干扰效率,将此序列构建到慢病毒载体中获得了干扰CaMKⅡδ的病毒载体。成功从新生大鼠心脏分离培养出原代心肌细胞,并通过免疫组化和免疫荧光鉴定培养的心肌细胞纯度可达到90%以上。将制备的慢病毒浓缩到108 TU/ml以上,按MOI=10转染原代心肌细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪检测感染率可以达到70%。而进一步通过western blot和qPCR检测过表达及干扰病毒的效果,发现过表达病毒转染的细胞CaMKⅡδ表达为对照病毒的两倍,而干扰病毒转染后,CaMKⅡδ表达约为对照病毒的50%。从而成功的在原代细胞中获得了CaMKⅡδ的过表达和干扰。对原代心肌细胞进行电场刺激后检测CaMKⅡδ变化,发现CaMKⅡδ的活性增加,但是表达量未发生变化。进一步检测过表达和干扰CaMKⅡδ的细胞,其表达量在电场刺激前后均未发生变化。在未刺激情况下,CaMKⅡδ的表达变化会导致内质网钙释放和L型钙流的变化。高表达细胞中,L钙流增加了约25%;而低表达细胞中,其下降了约28%。在电场刺激情况下,CaMKⅡδ表达依然导致了胞内钙的变化。L钙流在高表达细胞中增加了23%,而在低表达细胞中降低了26%。降低CaMKⅡδ表达量,可以将电刺激导致的钙流增强降低到正常水平。结论本研究主要结论:电场刺激导致原代心肌细胞内钙变化,此过程中CaMKⅡδ活性增加,但表达量未变化。通过过表达或RNA干扰改变CaMKⅡδ表达量,可以调节电场刺激导致的钙变化,从而改善电异常环境下的胞内钙。