论文部分内容阅读
目的：通过研究雷公藤内酯醇（TP）联合紫杉醇对耐顺铂人上皮性卵巢癌细胞（COC1/DDP细胞）凋亡的影响，以探讨两药联合对COC1/DDP细胞作用的机制，为TP联合紫杉醇应用于临床治疗耐药性卵巢癌及扩大TP应用谱提供可行性依据。方法：1、将COC1/DDP细胞用含0.5ug/mlDDP，10%胎牛血清，90%RPMI-1640培养基置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的恒温培养箱内培养，选用呈对数生长细胞进行实验。整个实验分为6个组：空白对照组（加入完全培养基）、3.13ug/ml紫杉醇组、10umol/ml PI3K特异性抑制剂LY294002组、10ng/ml雷公藤内酯醇（TP）组、10umol/ml LY294002+3.13ug/ml紫杉醇组及10ng/mlTP+3.13ug/ml紫杉醇组。2、MTT法检测各实验组分别作用于COC1/DDP细胞24h、48h、72h之后，对细胞的增殖抑制作用，计算各组抑制率。3、普通光镜及AO/EB染色荧光显微镜下观察各实验组药物作用24小时以后细胞形态的改变。4、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测各实验组药物作用24小时以后细胞凋亡率。5、Western blot检测空白对照组及各组药物作用COC1/DDP细胞24小时后细胞内AKT、P-AKT、GSK3β、P-GSK3β的表达的差异。结果：1、不同组药物作用COC1/DDP细胞后对细胞增殖的影响各组细胞给予不同药物分别作用24、48、72h后，MTT检测各组细胞的增殖抑制率，从紫杉醇组→LY294002组→TP组→LY294002+紫杉醇组→TP+紫杉醇组，药物作用24小时后细胞增殖抑制率分别为：39.33±3.567%、6.52±1.229%、45.61±2.645%、49.45±2.75%、56.09±3.131%；药物作用48小时后细胞增殖抑制率分别为：50.74±2.763%、18.52±1.145%、57.05±2.491%、66.33±3.471%、72.85±1.803%；药物作用72小时后细胞增殖抑制率分别为：63.34±7.712%、32.787±2.726%、71.08±3.484%、86.33±3.583%、89.60±2.284%。结果表明TP+紫杉醇组抑制率高于TP、紫杉醇单用（P<0.05）。LY294002+紫杉醇组抑制率高于LY294002、紫杉醇单用（P<0.05）。在联合用药组中TP+紫杉醇组抑制率高于LY294002+紫杉醇组（P<0.05）。在单用药组中TP组>紫杉醇组> LY294002组（P<0.05）。各组抑制率随药物作用时间延长而增高。2、不同组药物作用COC1/DDP细胞后细胞形态的变化（1）普通光学显微镜下观察COC1/DDP细胞形态的变化空白对照组COC1/DDP细胞增殖良好，在普通光学显微镜下可见呈椭圆形，细胞核为卵圆形，染色质丰富，折光性好。按不同分组药物作用细胞24小时后，在普通光学显微镜下可见各组细胞数目出现不同程度的减少，细胞形态发生凋亡样改变：如细胞质空泡形成，细胞核固缩、碎裂等。各组细胞形态改变结果表明联合用药组的细胞凋亡数明显高于各单用药组，其中TP联合紫杉醇组高于LY294002联合紫杉醇组，而各单用药组中TP作用凋亡数最多，LY294002作用凋亡数相对最少。（2）AO/EB染色后荧光显微镜观察COC1/DDP细胞形态的变化空白对照组COC1/DDP细胞经AO/EB染色后在荧光显微镜下观察细胞形态结构正常，呈绿色荧光。按不同分组药物作用细胞24小时后，经AO/EB染色在荧光显微镜下可见，紫杉醇组细胞核染色质呈绿色荧光，但形态为固缩状或圆珠状，呈早期凋亡改变；LY294002组细胞呈绿色荧光，出现早期凋亡改变，但数目少于紫杉醇组；雷公藤内酯醇组（TP组）细胞大多细胞染色质呈固缩状或圆珠状，着橘红色荧光，呈晚期凋亡改变，少数细胞呈早期凋亡改变，可见正常细胞；LY294002联合紫杉醇组，大多数细胞呈早期凋亡改变，少数呈晚期凋亡，仍少数可见正常细胞，凋亡细胞数大于TP单用组；TP联合紫杉醇组，细胞基本呈早期及晚期凋亡改变，基本未见正常细胞，凋亡细胞数大于LY294002联合紫杉醇组。各组细胞形态改变结果与普通光镜观察结果相符。3、各组药物作用于COC1/DDP细胞后检测细胞凋亡率COC1/DDP细胞经各组药物作用24小时后，分别进行AnnexinⅤ-FITC／PI凋亡染色，流式细胞仪检测显示凋亡率分别为：紫杉醇组（14.90±1.253）%、LY294002组（11.20±1.682）%、TP组（39.0±3.816）%、LY294002+紫杉醇组（27.67±1.834）%、TP+紫杉醇组（51.13±3.325）%、空白组（5.87±1.815）%。结果表明：两联合用药组凋亡率高于各自单药组，TP+紫杉醇组凋亡率高于LY294002+紫杉醇组，各单药组中凋亡率从高到底依次为：TP组、紫杉醇组、LY294002组。在空白对照组中可见少量凋亡，多次重复试验仍可见，表明COC1/DDP细胞在没有任何药物作用的情况下，经过24小时生长后，少数细胞自然发生凋亡，各组结果与空白组比较P<0.05具有统计学意义，联合用药组与相应单药组相比具有统计学差异。4、药物作用COC1/DDP细胞24小时后细胞中AKT、P-AKT、GSK3β、P-GSK3β表达的变化结果显示药物作用24小时后，各实验组总AKT蛋白的表达一致，并未发生任何改变，P-AKT蛋白的表达从空白对照组到→紫杉醇组→LY294002组→TP组→LY294002+紫杉醇组→TP联合紫杉醇组呈现出减少趋势，各实验组总GSK3β蛋白的表达一致，P-GSK3β蛋白的表达从空白对照组→TP联合紫杉醇组呈现出减少趋势。结论：1、紫杉醇、PI3K抑制剂LY294002、TP、LY294002联合紫杉醇及TP联合紫杉醇对体外培养的COC1/DDP细胞均具有增殖抑制作用，呈时间依赖关系。联合用药组的增殖抑制作用大于其相对应的各单药组。在各单药组中，TP抑制作用最大，LY294002最小。联合用药组中，TP联合紫杉醇的增殖抑制作用大于LY294002联合紫杉醇。2、PI3K抑制剂LY294002单独使用促进COC1/DDP细胞凋亡的凋亡率为（11.20±1.682）%，而TP单独使用时该细胞的凋亡率为（39.0±3.816）%，TP较LY294002对COC1/DDP细胞的促凋亡效果更显著。3、LY294002、TP均能协同紫杉醇促进COC1/DDP细胞凋亡，其中TP对紫杉醇的协同作用更大。4、紫杉醇、PI3K特异性抑制剂LY294002、TP、LY294002联合紫杉醇及TP联合紫杉醇作用COC1/DDP细胞均下调P-AKT、P-GSK3β表达，联合用药组下降最明显，TP具有类似LY294002作用，机制可能是通过抑制PI3K/AKT/GSK3β信号通路，协同紫杉醇促进COC1/DDP细胞凋亡。