论文部分内容阅读
背景和目的肿瘤发展除了与基因突变有关外,肿瘤微环境的改变也起到了关键作用。外泌体是细胞释放于体液中的一种天然的内源性细胞外小囊泡,其内选择性地携带大量生物活性物质,在TME中发挥重要的信息传递功能。Micro RNA（mi RNA）是外泌体中浓度最大的RNA,脂质双层膜的保护使得外泌体mi RNA比组织和体液中的游离mi RNA具有更强的耐降解能力和更高的生物稳定性,且容易检测。大量的前期研究证明了外泌体mi RNA是肿瘤恶性进程中的重要参与者,可用于肿瘤诊断和预后监测的潜在生物标志物。由于外泌体是TME中天然的信息传递系统,因此可以对其进行适当的修饰,将治疗性的mi RNA传递至靶细胞内进而实现治疗目的。本研究旨在研究外泌体mi R-1273g-3p及其靶基因VHL在胃癌恶性进程中的作用机制,为胃癌提供新的外泌体mi RNA诊断生物标志物,从而为胃癌的治疗提供新的思路。研究方法1.通过mi RNA表达谱芯片的微阵列分析获得胃癌患者与健康人群血清外泌体mi RNA的差异表达谱,扩大样本量进一步验证并筛选出对胃癌有诊断能力的目的mi RNA。使用生物信息学分析的方法初步探索目的mi RNA促进胃癌进展的可能机制。2.通过QRT-PCR实验分别检测mi R-1273g-3p在人胃癌细胞系及细胞系来源的外泌体中的相对表达水平。依据检测结果筛选出mi R-1273g-3p相对高/低表达的胃癌细胞系。3.使用mi R-1273g-3p模拟物（mimic）分别瞬时转染MKN-45、人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）,使用mi R-1273g-3p抑制物（inhibitor）分别瞬时转染HGC-27、HUVECs细胞。构建慢病毒感染HGC-27细胞,建立稳定敲减mi R-1273g-3p的HGC-27细胞系。分离稳定敲减mi R-1273g-3p的HGC-27细胞系来源的外泌体,分别与MKN-45、HUVECs细胞共培养。通过QRT-PCR及Western Blot实验检测各细胞中mi R-1273g-3p及靶基因VHL的变化,通过细胞功能学实验检测各细胞生物学功能的变化及HUVECs细胞小管形成能力的变化。4.通过双荧光素酶报告基因实验及细胞免疫荧光实验验证mi R-1273g-3p与VHL的靶向调控关系。5.通过免疫组织化学染色实验检测VHL在胃癌组织内的相对表达水平,利用生物信息学分析方法探索VHL在胃癌中可能的作用机制。6.通过鸡胚绒毛尿囊膜实验观察外泌体mi R-1273g-3p对血管生成的影响。将稳定敲减mi R-1273g-3p的HGC-27细胞来源的外泌体与MKN-45细胞共培养,构建裸鼠皮下移植瘤模型,每周测量瘤体大小,4周后取出移植瘤,记录瘤体重量。使用HE和免疫组织化学染色观察皮下移植瘤的细胞学形态及评估瘤体内VHL和CD34的表达水平。研究结果1.微阵列分析筛选出5个有显著统计学差异的血清外泌体mi RNA,其中mi R-1273g-3p,mi R-4793-3p,mi R-619-5p和mi R-4440在胃癌患者血清外泌体中的表达上调,mi R-6782-5p的表达下调。QRT-PCR实验证实了mi R-1273g-3p、mi R-4793-3p和mi R-619-5p在胃癌患者血清外泌体中的表达水平显著高于健康人群,而且每个外泌体mi RNA均对胃癌表现出较强的诊断能力,ROC曲线下面积分别为0.779、0.782和0.754。通过生物信息学方法分析,mi R-1273g-3p、mi R-4793-3p和mi R-619-5p的共同靶基因中有4个与胃癌不良预后正相关的潜在靶基因,分别是XIAP,RAD51,E2F2和VHL。这4个潜在靶基因可能是通过NF-κB信号通路、癌症通路和RIG-I样受体信号通路参与胃癌的进展。2.在细胞及外泌体水平实验中,相比较GES-1细胞系,mi R-1273g-3p的表达水平在HGC-27细胞系中上调最显著,在MKN45细胞系中下调。相比较GES-1细胞系来源的外泌体,mi R-1273g-3p在HGC-27、MKN-45和AGS细胞系来源的外泌体中均上调。3.细胞平板克隆实验、CCK8实验以及EDU细胞增殖实验均显示mi R-1273g-3p对HGC-27及MKN-45细胞的增殖无明显影响。使用模拟物（mimic）过表达mi R-1273g-3p以后,促进了MKN-45、HUVECs细胞的侵袭和迁移及HUVECs细胞的小管形成,细胞中VHL的表达下调。使用抑制物（inhibitor）或者慢病毒抑制mi R-1273g-3p以后,则发生了相反的变化。此外,将稳定敲减mi R-1273g-3p的外泌体与MKN-45、HUVECs细胞共培养,细胞的侵袭和迁移及HUVECs细胞的小管形成也受到显著抑制,细胞中VHL的表达上调。4.双荧光素酶报告基因实验及细胞免疫荧光实验结果表明mi R-1273g-3p能够直接靶向VHL并负性调控其蛋白翻译。5.免疫组织化学染色结果显示,与癌旁正常组织相比,胃癌组织中VHL的表达水平明显降低。生物信息学方法分析表明在胃癌的恶性进程中,VHL可能通过与EGLN1,EPAS1,CUL2,FN1,TCEB2,TCEB1,HIF1A,RBX1,VEGFA及PLAS4的相互作用来发挥抑癌功能。6.稳定敲减mi R-1273g-3p的HGC-27细胞来源的外泌体抑制了鸡胚绒毛尿囊膜中新生血管的生成,在裸鼠皮下移植模型体内减缓了MKN-45细胞移植瘤的生长,瘤体内VHL的表达上调,血管生成减少。结论1.外泌体mi R-1273g-3p、mi R-4793-3p和mi R-619-5p在胃癌患者血清中的表达上调,均可作为胃癌诊断的潜在生物标志物。2.Mi R-1273g-3p是胃癌的一种促癌mi RNA,能够促进胃癌的侵袭、迁移及靶向VHL促进胃癌的血管生成。3.Mi R-1273g-3p可以通过外泌体的传递促进胃癌的侵袭、迁移及靶向VHL促进胃癌的血管生成,是胃癌进展的一种新机制,为更好的研究外泌体mi RNA在胃癌中的作用增加了新证据。靶向外泌体mi R-1273g-3p有望成为胃癌治疗的新方案。