论文部分内容阅读
核糖核酸酶A（RNaseA）是一种细胞毒性蛋白,能够切断细胞的RNA从而使细胞凋亡。本文利用4-硝基苯基（4-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基）苄基）碳酸酯（NBC）对RNaseA进行修饰,发现NBC修饰能有效抑制RNaseA的活性[1],形成RNaseA前药—RNaseA-NBC。NBC是硼酸酯类小分子,能在H2O2的作用下,发生重排,促使蛋白RNaseA上修饰的基团掉落,恢复其活性。为了同时运输RNaseA前药以及底物RNA链,从而观察前药在细胞内的响应,我们制备了基于不同正电荷脂类分子的脂质体纳米复合物。由于癌细胞中高表达H2O2,所以高浓度的H2O2能激活被运载到细胞中的RNaseA前药的活性。激活的RNaseA一方面能切断癌细胞中的RNA,促使细胞凋亡,另一方面末端修饰荧光基团的底物RNA链在RNaseA的催化下会被切断,荧光增强,这可用于癌细胞的选择性响应。通过荧光增强动力学和毒性动力学实验,我们能清楚地观察到RNaseA前药在细胞内的激活响应过程。（1）我们合成了有机小分子NBC。NBC修饰能抑制RNaseA的活性,加入一定量的过氧化氢后,RNaseA的活性能够得到有效恢复。我们利用MALDI-TOF和荧光仪等仪器对RNaseA修饰和响应前后的分子量以及酶活性进行了测定。（2）基于DPPC、DPPC+CHOL、EC16-1、EC16-80四种脂,我们制备了含有RNaseA-NBC和RNA底物的脂质体纳米复合物。通过DLS,AFM等手段,我们对形成的纳米复合物的粒径、表面电荷、形貌性能进行了表征。表征结果显示,合成的纳米颗粒形态呈圆形,尺寸大小均一。此外,我们对不同脂质体纳米复合物的负载率进行了测定。实验结果表明,除基于DPPC制备的脂质体纳米复合物外,其他三种脂质体复合物均有很好的负载率。随后,我们还对形成的纳米复合物进行了体外过氧化氢响应的研究,发现基于DPPC和DPPC+CHOL形成的脂质体纳米复合物的荧光增强效果最好。综合脂质体的形貌大小等表征和体外过氧化氢响应的结果,我们最终选取基于DPPC+CHOL制备的脂质体纳米复合物进行后续的细胞实验。（3）我们选择了MCF-7、HeLa和HEK-293T三种不同细胞,前两种是分别是乳腺癌细胞和宫颈癌细胞,后者为肾上皮正常细胞。为了测试脂质体纳米复合物进入细胞的能力,我们使用Rhodamine 6G标记了基于DPPC+CHOL制备的纳米复合物及各平行组,然后利用流式细胞仪,确定了脂质体进入不同细胞的时间曲线,找到了最佳孵育时间,并对细胞进行了共聚焦荧光成像。随后,我们进行了细胞内过氧化氢响应的测试。通过流式细胞分析和共聚焦荧光显微镜成像,我们发现脂质体纳米复合物能在细胞内发生过氧化氢响应,在MCF-7细胞中观察到了荧光显著增强,能达到10倍以上,且响应速度快。在同为癌细胞的HeLa细胞中,纳米复合物荧光增强不多,且响应速度较慢。对于肾上皮正常细胞HEK-293T,该纳米复合物进入细胞后,荧光强度没有变化。我们推测这是由于不同细胞表达的过氧化氢的浓度不同所导致。此外,我们对纳米复合物的细胞毒性进行了研究,发现其对MCF-7,HeLa细胞具有一定的细胞毒性,而对HEK-293T细胞几乎无细胞毒性,这说明该脂质体纳米复合物对高表达过氧化氢的癌细胞具有良好的响应性。综上所述,我们对RNaseA的可逆修饰进行了深入研究,制备了基于不同脂的含有RNaseA前药和RNA底物的纳米复合物,对RNaseA前药的性能及其在细胞内外激活动力学进行了探索。