【摘 要】
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目的:肿瘤是人类生命的重要威胁,其微环境又为肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及免疫逃逸提供了条件。现阶段,尚不清楚肿瘤微环境中哪些因素,对于肿瘤进展起到了促进作用。因此,对肿瘤微环境中影响肿瘤进展的因素进行研究,并探讨不同进展速率肿瘤的免疫微环境区别,是十分有意义且必要的。本研究拟先采用小鼠来源4T1细胞与BALB/c小鼠,研究进展速率不一致肿瘤微环境细胞组分差异,根据结果选取细胞标志物,采用GEO数据
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目的:肿瘤是人类生命的重要威胁,其微环境又为肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及免疫逃逸提供了条件。现阶段,尚不清楚肿瘤微环境中哪些因素,对于肿瘤进展起到了促进作用。因此,对肿瘤微环境中影响肿瘤进展的因素进行研究,并探讨不同进展速率肿瘤的免疫微环境区别,是十分有意义且必要的。本研究拟先采用小鼠来源4T1细胞与BALB/c小鼠,研究进展速率不一致肿瘤微环境细胞组分差异,根据结果选取细胞标志物,采用GEO数据库探讨这些标志物在头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）中的基因表达情况,以期为肿瘤微环境及免疫治疗研究,尤其是在HNSCC中继续进行相关研究,提供理论依据。方法:（1）建立进展速率不一致小鼠肿瘤模型。经综合考虑后,采用小鼠来源的乳腺癌细胞系4T1,对第一批BALB/c小鼠进行背部皮下肿瘤造模。处死小鼠后取得肿瘤组织,制备成肿瘤单细胞悬液并分为5份,取一份做初代肿瘤细胞培养,并在传代时小心去除可能存在的纤维细胞。随后,用第一批小鼠中进展最快与最慢的肿瘤细胞,分别进行第二批BALB/c小鼠的皮下肿瘤造模,按相同方式制备肿瘤单细胞悬液,并获得第二批小鼠初代肿瘤细胞;（2）对于获取的所有小鼠肿瘤细胞,采用MTS法、Ki67细胞免疫组化染色、CFSE流式细胞术检测细胞增殖速率,采用2-NBDG流式细胞术检测葡萄糖吸收量,采用划痕实验检测细胞迁移能力,采用流式细胞术检测CD44+CD24-/low肿瘤干细胞与免疫检查点相关蛋白;（3）对于所有肿瘤单细胞悬液,分别检测其淋巴细胞及亚类、髓样细胞、纤维细胞与肿瘤干细胞、以及免疫检查点相关蛋白MHC1与PD-L1,并对于进展情况不一致小鼠肿瘤的细胞及微环境,进行对比分析,初步探讨肿瘤浸润免疫细胞所起的作用;（4）根据肿瘤单细胞悬液检测结果,选取经典树突状细胞（conventional dendritic cell,c DC）相关标志物CD11c,纤维细胞相关标志物FSP1、VIM、α-SMA、Hsp47,以及免疫检查点相关标志物MHC1、PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3,采用GEO数据库,探讨这些标志物在HNSCC组织中的基因表达情况。结果:（1）成功建立进展速率不一致小鼠肿瘤模型,第一批小鼠中进展速率较快的肿瘤来源细胞,其在第二批小鼠中诱发肿瘤进展速率高于另一组,差异具有统计学意义;（2）肿瘤来源细胞相关实验显示,第一批小鼠对比分析无明显差异。第二批小鼠中,进展速率不一致的肿瘤细胞,其增殖速率、迁移能力、干细胞占比、PD-L1蛋白表达水平无明显差异,而进展速率快的肿瘤细胞葡萄糖吸收能力高于另一组,CD44+/CD24+细胞占比、MHC1阳性细胞率以及平均表达量均低于另一组,差异具有统计学意义;（3）肿瘤微环境相关实验中,第一批小鼠对比分析无明显差异,第二批小鼠中,进展速率快的肿瘤微环境中干细胞占比高于另一组,纤维细胞与c DC占比低于另一组,差异具有统计学意义;（4）HNSCC中的纤维细胞相关标志物FSP1、VIM、Hsp47的基因表达情况,与肿瘤微环境纤维细胞占比情况一致。结论:（1）通过两代小鼠,成功建立进展速率不一致小鼠肿瘤模型;（2）进展速率不一致的肿瘤,其肿瘤细胞本身增殖速度无明显差异,但其糖吸收率、CD44+/CD24+细胞占比、MHC1蛋白表达水平均存在统计学差异;（3）不同进展速率肿瘤的微环境中,肿瘤干细胞、纤维细胞、c DC的占比存在统计学差异,可能与肿瘤进展有关;（4）HNSCC中纤维细胞相关标志物FSP1、VIM、Hsp47的基因表达情况,与肿瘤微环境纤维细胞占比情况一致,为在HNSCC中继续进行相关研究,提供了理论依据。
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