甲状腺相关眼病(Thyroid-associatedophthalmopathy，TAO)是一种与甲状腺密切相关的自身免疫性疾病，是导致成人眼球突出最常见的眼眶病。TAO主要的临床表现是眼球突出，导致眼球突出的主要原因是眼眶内眼外肌增粗及眶脂肪容积增加，其中眶脂肪受累者占TAO患者一半以上。眶脂肪容积增加在TAO中的作用及发病机理越来越受到国内外学者的关注。研究显示，前脂肪细胞纤维母细胞(眶纤维母细胞的一个亚群)暴露于适当的旁分泌刺激能够分化成脂肪细胞。虽然导致这个效应的激素、细胞因子仍不能详细描述，但已清楚TAO患者眼眶脂肪组织更细胞化(cellular)，能够分化成脂肪细胞的前脂肪细胞占更高比例。 过去，脂肪组织仅仅被看作是一个能量储存器官，随着一系列具有生物活性脂肪细胞因子的相继发现，包括瘦素、脂联素、肿瘤坏死因子α、白介素-6、纤溶酶原活性抑制剂-1以及抵抗素(resistin)，脂肪组织已被看作一个内分泌器官。抵抗素是近年来新发现的一种脂肪细胞因子，主要存在于脂肪组织中，由成熟脂肪细胞合成分泌，能够进入血液到达远处的组织器官发挥生物学效应。研究表明，抵抗素对体外培养细胞有诱导增殖的作用，包括内皮细胞、平滑肌细胞及前脂肪细胞。同时抵抗素对前脂肪细胞的分化亦有一定的作用，多数研究报道抵抗素可抑制3T3-L1前脂肪细胞分化，仅有一篇报道其对前脂肪细胞的分化有促进作用。基于此本研究选择抵抗素这一脂肪细胞因子来研究，研究其在TAO患者眶脂肪及血清中的表达水平以及重组的人抵抗素对体外培养的眶前脂肪细胞增殖、分化的影响。 本课题研究内容包括四个部分 第一部分正常人眼眶组织中抵抗素表达研究 [目的]：了解在正常人眼眶脂肪组织及眼外肌组织中抵抗素基因mRNA及蛋白的表达情况。 [方法]：眼眶脂肪组织来自眼球摘除患者，眼外肌于斜视患者眼肌缩短术中获得。通过RT-PCR法检测人眼眶脂肪组织及眼外肌组织中抵抗素基因mRNA的表达情况；免疫组织化学法检测抵抗素蛋白在人眼眶脂肪组织及眼外肌组织中的表达。 [结果]：在正常人眼眶脂肪组织及眼外肌组织中均有抵抗素基因mRNA的表达，PCR产物电泳结果示产物片段约500bp，脂肪组织中抵抗素基因表达相对灰度值为0.254±0.025，眼外肌组织中抵抗素基因表达的相对灰度值为0.178±0.016，脂肪组织中抵抗素基因表达高于眼外肌组织(P＜0.005)。抵抗素蛋白表达位于细胞胞浆，免疫组织化学显示正常人眼眶脂肪组织及眼外肌组织中均有抵抗素蛋白存在。 第二部分TAO患者眼眶前脂肪细胞中抵抗素表达的诱导研究 [目的]：通过检测抵抗素在TAO患者眼眶前脂肪细胞培养分化过程中的表达，进一步研究前脂肪细胞的分化过程。 [方法]：选用TAO患者和正常对照眼眶脂肪组织，在体外通过组织块培养法获取前脂肪细胞，前脂肪细胞在分化液的作用下分化为成熟脂肪细胞。利用RT-PCR法检测前脂肪细胞及成熟脂肪细胞中抵抗素基因mRNA的表达，对前脂肪细胞及成熟脂肪细胞进行免疫组化、WesternBlot检测抵抗素蛋白的表达，通过ELISA方法对细胞培养液中抵抗素蛋白水平进行检测。 [结果]：前脂肪细胞中无抵抗素基因mRNA及蛋白的表达。成熟脂肪细胞中有抵抗素基因mRNA及蛋白的表达。免疫组化结果显示抵抗素蛋白位于成熟脂肪细胞胞浆中。WesternBlot法检测显示成熟脂肪细胞在分子量约12.5KDa处见阳性印记条带。ELISA法检测细胞培养液，前脂肪细胞培养液中检测不到抵抗素蛋白的存在，成熟脂肪细胞培养液中抵抗素蛋白水平在13-35pg/ml范围。 第三部分TAO患者眶脂肪及血清中抵抗素的测定 [目的]：检测甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪组织及血清中抵抗素的表达水平，为进一步研究抵抗素在TAO发病中的作用打下基础。 [方法]：眼眶脂肪组织TAO患者(16例)来源于严重的TAO行眼眶减压术时，正常对照(10例)，通过RT-PCR法检测甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪组织中抵抗素基因的表达情况；部分脂肪组织进行组织块培养，孵育48小时后离心取上清。TAO患者血清样本来自有典型临床症状的TAO患者35例，按CAS临床活动性评分标准将其分为两大组：非活动期(CAS＜4)18例和活动期(CAS≥4)17例，另外选取正常对照15例。使用ELISA法检测组织块培养液及血清中抵抗素蛋白的表达情况。 [结果]：1、TAO患者脂肪组织中抵抗素基因表达的相对灰度值为0.325±0.019，正常对照眼眶脂肪组织中抵抗素基因表达的相对灰度值为0.252±0.026；TAO患者眼眶脂肪组织中抵抗素基因表达高于正常对照眼眶脂肪组织，差异有统计学意义(P＜0.005)。2、TAO患者眼眶脂肪组织块培养液中抵抗素蛋白浓度为39.390±4.619pg/ml,正常对照眼眶脂肪组织块培养液中抵抗素蛋白浓度为25.557±4.115pg/ml，两者的差别有统计学意义(P＜0.005)。3、甲状腺相关眼病患者血清中抵抗素蛋白水平为12.767±4.450ng/ml，正常对照组为21.894±10.589ng/ml，患者明显低于正常对照组，差别有统计学意义(P＜0.005)。活动期与非活动期甲状腺相关眼病患者血清中抵抗素蛋白水平的差异无统计学意义(P＞0.05)。男女患者血清中抵抗素水平无统计学差异(P＞0.05)，随年龄增加血清中抵抗素水平升高，差别有统计学意义(P＜0.005)。 第四部分重组人抵抗素对TAO患者眼眶前脂肪细胞 增殖及分化的影响[目的]：探讨重组人抵抗素对眼眶前脂肪细胞及成纤维细胞增殖的影响，及对前脂肪细胞分化的作用，阐明抵抗素在TAO发病中可能的作用。 [方法]：培养TAO患者及正常对照眼眶前脂肪细胞，采用MTT比色试验法及细胞计数法研究重组人抵抗素对前脂肪细胞及成纤维细胞增殖的影响，按抵抗素浓度将实验分6组：阴性对照组(R0)，10ng/ml抵抗素组(R10)，25ng/ml抵抗素组(R25)，50ng/ml抵抗素组(R50)，100ng/ml抵抗素组(R100)及阳性对照组(5％胎牛血清，FBS)。通过对分化末期脂肪细胞进行油红O染色，从形态上来观察抵抗素对前脂肪细胞分化的作用。采用RT-PCR法检测分化过程相关基因的表达，研究重组人抵抗素对前脂肪细胞分化的作用。 [结果]：1、重组人抵抗素对人眼眶前脂肪细胞及成纤维细胞的增殖有促进作用，呈剂量依赖形式，吸光度值及细胞数量之间的差别均有统计学差异(P＜0.05)。随抵抗素浓度的增加，增殖率逐渐升高，前脂肪细胞分别为：2.52％、9.84％、16.36％、19.11％。2.重组人抵抗素对人眼眶前脂肪细胞的分化有抑制作用，油红O染色显示随抵抗素浓度的升高，被分化的前脂肪细胞数量减少；RT-PCR结果显示PPARγ及TSHR基因的表达随着抵抗素浓度的升高而减弱，差别有统计学意义(P＜0.005)。 结论1、在人眼眶脂肪组织及眼外肌组织中可检测到抵抗素基因mRNA及蛋白的表达，抵抗素可能与眼眶炎性疾病，如甲状腺相关眼病、炎性假瘤等有一定的关系。 2、眼眶脂肪组织中抵抗素基因mRNA表达高于眼外肌组织，说明抵抗素主要在脂肪组织中表达。 3、TAO患者眼眶脂肪组织来源的前脂肪细胞能够在体外适当条件下分化为成熟脂肪细胞，说明TAO眼眶脂肪组织中存在具有分化功能的前脂肪细胞，脂肪细胞分化过程活跃。 4、前脂肪细胞中无抵抗素表达，抵抗素基因mRNA及蛋白的表达随着脂肪细胞的分化而增加，仅存在于脂肪细胞中，可作为脂肪细胞分化的标记物。 5、前脂肪细胞培养液中检测不到抵抗素蛋白的存在，而分化成熟脂肪细胞培养液中可稳定检测到抵抗素蛋白的水平，一方面证明分化成熟的脂肪细胞是具有分泌功能的，另一方面提示脂肪细胞强大的内分泌功能可能影响着TAO的发生、发展。 6、TAO患者眼眶脂肪组织中抵抗素基因mRNA的表达明显高于对照组，并且TAO眼眶脂肪组织块培养液中抵抗素蛋白水平高于对照组，充分说明TAO患者眼眶脂肪组织中脂肪细胞的分泌功能活跃。 7、TAO患者血清中抵抗素水平低于正常人，说明影响血清中抵抗素水平的仍是甲状腺激素，并且血清中抵抗素水平随年龄增加而升高。 8、重组人抵抗素能够诱导体外培养眼眶脂肪组织来源的前脂肪细胞及眼外肌来源成纤维细胞的增殖，且呈剂量依赖，提示眼眶内脂肪细胞合成分泌的抵抗素可能通过旁分泌影响眼眶内前脂肪细胞及成纤维细胞的增殖，从而参与TAO的发病过程。 9、重组人抵抗素可抑制人眼眶脂肪组织来源前脂肪细胞的分化，脂肪细胞标记性PPARγ基因的表达减弱，同时眼眶与甲状腺的共同致病抗原TSHR的表达亦减弱，有望在TAO治疗方面开创新的研究方向。