背景心力衰竭是发达国家和发展中国家的主要死因之一。心肌重构是心力衰竭的重要病理过程,初始状态下的心肌重构是心脏对多种刺激因子(神经体液因子、压力负荷、容量负荷、机械刺激、心肌炎或者遗传突变)的适应性反应,使心脏维持正常的心功能,然而持续的心肌重构最终会导致心力衰竭。心肌肥厚是多种因素诱导的心肌重构的病理表现之一。心肌肥厚主要表现为心肌细胞体积的增大,蛋白质合成增多,心脏胚胎基因的激活,心肌细胞钙处理能力的下降以及细胞代谢方式的改变。上述因素影响心肌细胞的存活,除此之外,心肌细胞外基质环境改变,纤维化明显。多种细胞因子参与了压力负荷诱导的心肌重构过程,通过结合心肌细胞膜表面的受体激活多种细胞内的信号通路,如MAPK, PI3K-AKT, NFAT等使心肌细胞发生上述改变。近期研究表明,炎症细胞(巨噬细胞,T淋巴细胞等)在压力负荷诱导的心肌重构过程发挥着重要作用,炎症细胞可以通过分泌多种细胞因子参与心肌重构的调节。因此,免疫细胞的调节可能成为治疗压力负荷诱导的心肌重构的新策略。OX40(CD134),又称肿瘤坏死因子受体家族4(tumour necrosis factor receptor super family-4, TNFrsf4)最初在激活的CD4+T淋巴细胞发现,后续研究发现其同样表达于激活的CD8+T细胞和中性粒细胞。在T细胞受体被激活后的48-72小时,OX40表达达到高峰,在120小时的时候开始下降。其作为T淋巴细胞表面的共刺激分子促进CD4+和CD8+T淋巴细胞活化、增殖、分化和效应。OX40同样表达于FoxP3+ CD25+ CD4+调节性T细胞(Treg),参与调节Treg细胞的免疫抑制效应。在压力负荷诱导的心肌重构过程中,T淋巴细胞被招募到心脏参与心肌重构的病理过程。近期研究表明在压力负荷诱导的心肌重构中T淋巴细胞可以通过与多种免疫细胞相互作用激活、调节或抑制炎症反应。因此,我们猜想是否能够通过改变CD4+T淋巴细胞分泌的抑炎症因子和促炎因子的比例,改善压力负荷诱导的心肌重构；OX40是否可以通过调节CD4+T淋巴细胞的活化、增殖、分化参与调节压力负荷诱导的心肌重构?在本研究中,我们通过使用OX40基因敲除小鼠来探寻OX40在压力负荷诱导的心肌重构中的作用。方法实验一：采用雄性C57BL/6小鼠建立主动脉缩窄(aortic banding, AB)模型。分别取术后1周、2周、4周的心脏,提取心脏总蛋白和RNA。采用western bloting检测术后不同时间点心脏组织中OX40蛋白的表达改变；采用RT-PCR检测术后不同时间点心脏组织中OX40转录水平的改变。采用免疫组化染色定位心脏组织中OX40的表达位置。提取原代大鼠乳鼠心肌细胞,采用Ang Ⅱ刺激48h,提取心肌细胞总蛋白和RNA。采用western bloting检测刺激前后心肌细胞中OX40蛋白的表达改变；采用RT-PCR检测刺激前后OX40转录水平的改变。实验二：采用OX40基因敲除小鼠和其同窝出生的野生型小鼠,将其随机分为手术组(AB)和假手术组(sham)。AB术后8周,取各组小鼠心脏并记录小鼠心重、肺重、胫骨长度。计算每组小鼠心重体重比(heart weight/body weight, HW/BW)、肺重体重比(lung weight/body weight, LW/BW)和心重胫骨长度比(heart weight/tibial length, HW/TL)以及肺重胫骨长度比(lung weight/tibial length, LW/TL);采用HE染色,PSR染色评价心肌细胞横截面积和胶原含量；采用RT-PCR检测心肌肥厚和纤维化分子标志物的转录水平；取AB术后2周的小鼠心脏,采用RT-PCR检测心脏炎症因子的转录水平；病理染色CD68、CD45、 CD4、CD8评价各组心脏炎症细胞浸润程度。总体评价OX40全身基因敲除后是否改变压力负荷诱导的心肌重构程度。实验三：使用免疫磁珠分离野生型(wild type, WT)小鼠和OX40敲除小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,在RIMP-1640培养基中培养,使用5μg/mL抗CD3ε抗体和1μg/mL抗CD28单克隆抗体刺激48小时激活CD4+T淋巴细胞,采用细胞计数试剂检测两组CD4+T淋巴细胞的增殖。收集CD4+T淋巴细胞激活后的上清液,采用酶联免疫吸附法检测两组CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子。将两组CD4+T淋巴细胞激活后的上清液加入到饥饿12小时的原代大鼠心肌细胞,给予1 μM Ang Ⅱ刺激48小时。使用细胞免疫荧光染色技术对心肌细胞进行形态学染色,研究其肥大程度。Western Blotting检测心肌细胞肥大的分子标志物蛋白的表达水平。评价OX40是否通过改变CD4+T淋巴细胞的功能影响心肌细胞对AngⅡ的肥厚反应。结果实验一：Western Blotting口PCR结果提示心脏组织中表达的OX40在AB术后1周开始增高,2周时达到高峰,4周下降到基础水平。免疫组化结果显示心脏组织中的OX40主要表达于间质细胞。离体实验的结果表明,基础状态下OX40在心肌细胞中表达极低,在给予Ang Ⅱ刺激后48h之后,心肌细胞中OX40的表达无明显改变。实验二：术后8周,AB组小鼠HW/BW、HW/TL、LW/BW、LW/TL显著增高,而OX40缺失能明显减少上述指标的增加；HE染色结果显示,OX40缺失延缓AB引起的心肌细胞横截面积的增大；超声心动图和血流动力学结果显示：OX40缺失能够改善AB术后心室腔扩大、心室壁增厚,表现为与WT相比,OX40缺失小鼠左室舒张末内径,左室收缩末内径明显下降；OX40缺失小鼠收缩和舒张功能显著增强,表现为短轴缩短率、射血分数、心输出量增加,左室压力上升最大速率、左室压力下降最大速率明显增加,而左室舒张末内压明显下降。PSR染色显示,OX40缺失减轻AB术后心肌间质和血管周围胶原沉积。RT-PCR结果显示,OX40缺失减少心肌组织中肥厚标志物的转录,其中包括心房钠尿肽、B型利钠肽、肌球蛋白重链β,而α-肌球蛋白重链和SERCA2a转录水平明显上升；OX40缺失能减少纤维化分子标志物的转录：包括结缔组织生长因子、Ⅰ型溶胶原α1、Ⅲ型溶胶原α1和Fibronectin。取AB术后2周的心脏发现与WT小鼠相比,OX40缺失小鼠心肌组织中促炎症因子IL-1β、IL-6和TNFa的转录水平显著降低；心脏组织中炎症细胞(白细胞、巨噬细胞、CD4+ T、CD8+ T淋巴细胞)浸润显著减少。实验三：分离培养小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,使用5μg/mL抗CD3ε抗体和1μg/mL抗CD28单克隆抗体激活。CCK8和ELISA结果显示OX40基因敲除小鼠脾脏来源的CD4+T淋巴细胞增殖减少,促炎症细胞因子分泌减少包括TNFα、IL-2和IFN-γ,抑炎因子IL-10分泌增多。将各组CD4+T淋巴细胞激活后的培养介质加入到原代大鼠心肌细胞,给予Ang Ⅱ刺激后发现,OX40基因敲除小鼠脾脏来源的CD4+ T淋巴细胞培养介质能明显改善心肌细胞对Ang Ⅱ刺激引起的肥大反应,主要表现为与WT小鼠脾脏来源的CD4+ T淋巴细胞培养介质孵育的心肌细胞相比,心肌细胞横截面积和肥厚分子标志物ANP、β-MHC蛋白表达水平明显下降。结论1.在压力负荷诱导的小鼠心肌组织中OX40表达水平在术后1周开始升高,术后2周时达到高峰,4周恢复到基础水平；OX40主要定位于心脏间质细胞；OX40在心肌细胞中的表达极低,且在Ang Ⅱ诱导心肌细胞肥厚模型中,OX40表达水平无明显改变。2.OX40基因敲除可改善压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚、纤维化、炎症反应程度；3.OX40基因敲除可减少CD4+T淋巴细胞的增殖,抑制促炎因子的释放,增加抑炎因子的释放；上述CD4+T淋巴细胞功能的改变可影响心肌细胞对Ang Ⅱ诱导细胞肥大反应。OX40可能通过改变CD4+T淋巴细胞功能影响压力负荷诱导的心肌重构的发生发展。