灰葡萄孢(Botrytis cinerea)是一种死体营养型真菌,寄主范围广泛,可危害多种重要经济作物。由于缺乏较好的抗病品种及杀菌剂滥用造成的抗药性和环境污染,因此需要一些对环境更为友好的替代防治措施,而生物防治就是其中之一。上个世纪CHV1成功应用于欧洲板栗疫病菌的防治表明真菌病毒是一种具有一定应用潜力的生防因子。此外,在灰葡萄孢中报道过可以影响寄主致病力的真菌病毒,因此从灰葡萄孢中寻找致病力衰退相关病毒可望为灰霉病的生物防治提供新的病毒资源。本研究从湖北荆门分离获得一株弱致病力灰葡萄孢菌株HBtom-372,由3种真菌病毒复合侵染,分别为Botrytis cinerea endornavirus 1(BcEV1),Botrytis cinerea hypovirus 1(BcHV1)和Botrytis cinerea fusarivirus 1(BcFV1)。BcEV1全长11557 bp,与Endornavirus有较高的同源性,5’端不含有缺刻,可编码一个3787 aa大小的开放阅读框(ORF),包含4个保守的结构域,依次是甲基转移酶(MTR)、半胱氨酸富含区域(CRRs)、解旋酶(Hel)和RNA依赖RNA聚合酶保守域(RdRp)。BcHV1全长10252 nt,可编码一个2964 aa大小的ORF,包含4个保守的结构域,分别是papain-like蛋白酶(Prot)、葡萄糖基转移酶(UGT)、RdRp和Hel保守域,末端还有一个poly(A)尾。BcFV1全长8448 nt,包含一个poly(A)尾,可编码两个ORF,大小分别为1644 aa和715 aa,第一个ORF包含RdRp和Hel这两个保守域,第二个ORF编码的蛋白功能未知。这三种病毒可通过菌丝融合从菌株HBtom-372传入强毒菌株HBtom-459中,产生的衍生菌株Z26(BcEV1、BcHV1和BcFV1)、Z1(BcHV1和BcFV1)、Z3(BcHV1和BcFV1)和Z33(BcHV1)的致病力都出现严重衰退,且侵染垫的数量相对于HBtom-459都显著性下降。单独感染BcHV1的菌株Z33的菌落形态和生长速度正常,但致病力衰退且侵染垫形成受抑制,但在刺伤接种后,致病力可恢复,并且与侵染垫相关基因的表达水平发生改变,表明BcHV1介导的弱毒特性可能与抑制侵染垫的产生有关。BcEV1、BcFV1和BcHV1在我国灰葡萄孢群体中的分布频率分别约为4.3%、29.6%和14.3%。通过转录组测序比较含BcHV1的Z33和强毒菌株HBtom-459在转录水平上的异同,从转录组层面上阐述BcHV1对灰葡萄孢的影响。在菌丝阶段,菌株Z33和HBtom-459的差异表达基因(DEGs)有853个,上调基因有342个,下调基因有511个。在侵染阶段,接种洋葱表皮9 h后开始产生侵染垫,此时菌株Z33和HBtom-459的DEGs有674个,上调基因有388个,下调基因有286个。在菌丝阶段和侵染阶段,病毒感染后的上调表达相同的DEGs为95个,下调表达相同的DEGs为127个,在病毒BcHV1感染且在侵染的阶段,特异性上调表达基因为293个,特异性下调表达基因为159个,特异性表达的基因一共有452个,包括一些细胞壁降解酶类、毒素合成、转运子、铜锌超氧化物歧化酶基因,转录因子及与致病相关的基因。根据KEGG通路富集分析,结果表明DEGs主要富集在代谢、次生代谢、糖类代谢及各种氨基酸代谢途径,猜测这些通路可能与BcHV1介导的弱毒特性相关。利用宏病毒组(Metatranscriptomic)对全国12个省(市)收集的508株灰葡萄孢菌株中的真菌病毒的多样性进行分析。结果表明,根据核酸类型分类,灰葡萄孢群体中的(+)ssRNA病毒共44种,占58.2%;(-)ssRNA病毒共18种,占22.8%;dsRNA病毒共16种,占17.7%;DNA病毒1种,仅占1.3%;共获得了约79种病毒。系统进化分析表明,这些病毒可能主要隶属于以下17个病毒科(属),+ssRNA病毒包括:减毒病毒科(Hypoviridae)、裸露RNA病毒科(Narnaviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、欧密尔病毒属(Ourmiavirus)、Fusariviridae、δ-线性病毒科(Deltaflexiviridae)、γ-线性病毒科(Gammaflexiviridae)和芜菁花叶病毒科(Tymoviridae);-ssRNA病毒包括:布尼亚病毒目(Bunyavirales)、弹状病毒科(Rhabdoviridae),单股负链RNA病毒科(Mymonaviridae)和副黏液病毒科(Paramyxoviridae);dsRNA病毒包括:内源RNA病毒科(Endornaviridae)、双分体病毒科(Partitiviridae)、单分体病毒科(Totiviridae)和Botybirnavirus;DNA病毒是类双生病毒科(Genomoviridae)。此外,还发现了4种分类地位尚未明确的病毒,与Sclerotinia sclerotiorum tetramycovirus-1、Botrytis cinerea RNA virus 1、Sclerotinia sclerotiorum dsRNA mycovirus-L有一定同源性。对其中的一种-ssRNA病毒Botrytis cinerea mymonavirus 1(BcMyV1)进行了全长序列的克隆。结果表明,BcMyV1全长为7863 nt,可编码3个ORF(ORF1~3),ORF1为1968 aa,包含RdRp和mRNA-capping region V两个结构保守域,ORF2和ORF3编码的蛋白功能未知。BcMyV1在灰葡萄孢群体中的分布频率较低,仅为0.8%。因此,高通量测序的应用可望发现一些在真菌群体中分布频率较低的病毒种类。在这些灰葡萄孢病毒中,已报道的病毒有44种,未报道的病毒有35种,揭示了灰葡萄孢病毒具有丰富的种类和多样性。首次在灰葡萄孢中发现DNA病毒,命名为Botrytis cinerea genomovirus 1(BcGV1),BcGV1的全长为1710 bp,在编码链可编码两个ORF,大的ORF为321aa,编码复制酶(Rep),Rep包含Genomoviridae这个科保守的7个motifs,分别为:Motif I、Motif II、GRS domain、Motif III、Walker A、Walker B和Motif C。小的ORF为129 aa,预测是衣壳蛋白(CP),两个ORF由大基因间隔区和小基因间隔区间隔开,在大的基因间隔区可预测到复制起始位点为TAACAGTAC。基于Rep进行系统进化树分析,BcGV1聚在Genomoviridae病毒科,但是不属于任何一个属,可能是一个新属。在34个灰葡萄孢菌株中检测到BcGV1,说明BcGV1在灰葡萄孢群体中分布非常广泛。