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目的:探究大鼠全脑缺血再灌注损伤(GCI/R)后TRB3的表达情况,同时探究下调 TRB3的表达对大鼠全脑缺血再灌注损伤所致神经元凋亡的影响及相关分子机制。 方法:⑴48只雄性成年SD大鼠,通过结扎双侧颈总动脉以及电凝双侧椎动脉建立大鼠GCI/R模型,缺血时间控制为10 min。于再灌注后1 h,6 h,12 h,24 h,72 h将大鼠断头取脑,采用免疫荧光技术检测 TRB3在大鼠海马中分布情况;应用western blot方法检测TRB3、凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2;内质网应激相关分子CHOP、ATF4,Caspase-12及TRB3下游分子p-Akt表达变化;应用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测神经元凋亡情况;采用免疫组化方法检测CHOP的表达变化。⑵TRB3 shRNA干扰慢病毒的构建及鉴定由上海吉凯生物化学技术有限公司完成。取18只大鼠,随机分为3组:对照组(Con组)、TRB3 shRNA干扰慢病毒组(Con+ LV-TRB3-RNAi组)、对照空病毒组(Con+ LV-control组)。后两组通过立体定位技术向大鼠海马CA1区注射TRB3 shRNA干扰慢病毒,对照空病毒。72 h后荧光显微镜下观察海马GFP的表达;Western blot检测海马组织TRB3的表达。⑶24只SD大鼠,随机分为4组,对照组(Con组)、缺血组(I/R72 h组)、TRB3 shRNA干扰慢病毒+缺血组(LV-TRB3-RNAi+I/R72 h组)、对照空病毒+缺血组(LV-control+I/R72 h组)。后两组于建立全脑缺血再灌注模型72 h前通过立体定位技术向大鼠海马CA1区注射TRB3 shRNA干扰慢病毒,对照空病毒。模型建立72 h后 Western blot法检测海马TRB3及其下游p-Akt、凋亡相关蛋白,内质网应激分子的表达变化。TUNEL法检测检测各组神经元凋亡情况。 结果:①TRB3表达于海马CA1、CA2、CA3及DG区,TRB3主要表达于神经元。GCI/R72 h后海马组织CA1区可观察到众多TUNEL阳性细胞。与Con组相比, GCI/R72 h后大鼠海马TRB3蛋白表达明显增加,其下游底物p-Akt表达减少,差异具有统计学意义(P<0.05);与Con组相比,大鼠GCI/R后内质网应激标志分子 Caspase-12,CHOP,ATF4表达增加,凋亡相关蛋白 Cleaved Caspase-3, Bax表达增加,Bcl-2表达降低,差异具有统计学意义。②TRB3 shRNA干扰慢病毒构建成功,其滴度为5×108 TU/ml。Con+LV-TRB3-RNAi组、Con+LV-control组大鼠海马 CA1区均有 GFP表达;Western blot及PCR结果显示,与对照组相比,TRB3 shRNA干扰慢病毒显著降低海马TRB mRNA及蛋白水平的表达,差异具有统计学意义。③Western blot结果显示,与 I/R72 h组、LV-control+I/R72 h组相比, LV-TRB3-RNAi+I/R72 h组海马TRB3表达明显降低,下游底物p-Akt表达明显升高,内质网应激标志分子 CHOP,ATF4,Caspase-12表达明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与 I/R72 h组、LV-control+I/R72 h组相比, LV-TRB3-RNAi+I/R72 h组海马 Cleaved Caspase-3,Bax表达明显降低,Bcl-2表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。LV-TRB3-RNAi+I/R72 h组TUNEL阳性细胞明显少于I/R72 h组及LV-control+I/R72 h组。 结论:⑴大鼠GCI/R后TRB3蛋白表达增加,此变化可能与GCI/R后内质网应激增强及神经元凋亡有关。⑵TRB3 shRNA干扰慢病毒构建成功,TRB3 shRNA干扰慢病毒能够下调海马组织TRB3的表达。⑶TRB3 shRNA干扰慢病毒可通过增加p-Akt水平及减弱内质网应激损伤减轻GCI/R后神经元凋亡。