研究背景：脂肪肝（fatty liver disease，FLD）是一种可逆性病变，主要表现为肝细胞脂肪变性。脂肪肝在各国的发病率为10%~24%。随着我国国民经济水平的提高，人们饮食结构、生活方式及生活习惯发生明显改变，脂肪肝的发病率不断增加。导致脂肪肝的两个最常见因素为非酒精性因素和HCV（hepatitisC virus，HCV）感染，非酒精性因素导致的脂肪肝称为NAFLD（non-alcoholicfatty liver disease，NAFLD）。NAFLD和HCV感染所导致的脂肪肝均表现为肝细胞内脂质聚集及脂滴（lipid droplet，LD）形成。LDs的基本结构是中性脂质核心，表面单层磷脂层和镶嵌在磷脂层的脂滴蛋白。目前，关于脂滴如何形成的机理尚不清楚，最流行的假说是脂质在内质网合成并在双层膜内聚集，随着体积的增大，膜结构向胞浆面膨出形成球状结构，并最终从膜结构脱离形成独立的LDs。LDs以往常被认为是单纯储存中性脂质的细胞内结构。近年来，LDs越来越受到重视，认为其是一个动态的细胞器，在许多细胞途径中发挥作用，包括与微管相作用进行主动转运。细胞内微管介导的转运是由kinesin和dynein家族的分子动力蛋白驱动的。kinesin介导正向转运，dynein介导负向转运，他们可以选择性地与微管结合从而控制细胞内结构的运动。在LDs生成过程中，一些蛋白发挥了重要作用，其中脂滴表面PAT家族蛋白可能发挥关键作用。在哺乳动物，PAT家族包含5个成员：perilipin、ADRP、TIP47、S3-12和OXPAT。PAT家族成员在分子大小、组织表达、与LDs的亲和力、稳定性及转录调节方面各不相同。但他们都具有高度同源的N末端PAT结构域，在调节细胞脂质代谢及LDs形成中发挥作用。1999年，TIP47被首先发现可以与6-磷酸甘露糖受体（mannose recepter6-phosphoric acid，MPR）结合介导其从内体到高尔基网络的转运。2001年，Wolins等发现TIP47与脂滴蛋白ADRP及perilipin高度相似，与初期LDs形成相关，应归为脂滴相关蛋白。但TIP47在LDs生成及代谢中的具体作用及分子机制并不清楚。深入研究TIP47在LDs生物学中的作用及机制将为脂肪肝等脂肪变性疾病的的防治提供分子理论基础。研究目的：本研究旨在确定TIP47蛋白在NAFLD和HCV感染导致的肝细胞脂肪变性中的作用；通过抑制TIP47蛋白在肝细胞中的表达确定TIP47蛋白对脂滴生成及脂质分布的影响；阐明细胞骨架在TIP47发挥生理功能中的作用，为脂滴生成模型提供分子基础。研究方法：1.制备兔抗小鼠TIP47多克隆抗体，确定TIP47在NAFLD动物模型ob/ob小鼠各种组织（尤其是肝脏）中的表达情况。2.构建稳定表达HCV核心抗原的肝癌细胞系，分析microRNA表达谱并预测其靶基因，分析脂滴相关蛋白PAT家族在HCV核心抗原导致的肝细胞脂肪变性中的作用。3.通过siRNA技术抑制肝细胞系AML12中TIP47的表达，观察细胞内脂滴形态变化及脂质分布情况，确定TIP47的细胞生物学功能；并进一步探讨微管蛋白在TIP47发挥生理功能中的作用。研究结果：1.成功制备兔抗小鼠TIP47多克隆抗体，并确定TIP47与NAFLD发生相关。运用分子生物学技术克隆表达了TIP47蛋白C末端398个氨基酸组成的可溶性蛋白，免疫新西兰兔，成功制备兔抗小鼠TIP47多克隆抗体。在NAFLD的动物模型ob/ob小鼠中，我们发现肝脏、骨骼肌、心肌和棕色脂肪组织等脂肪代谢活跃的组织TIP47表达明显高于野生型小鼠。提示TIP47在包括肝脏在内的组织细胞脂滴生成中发挥作用。2. HCV核心抗原3a和1b可以通过调节microRNA及其靶蛋白诱导肝细胞脂肪变性，并且PAT家族蛋白TIP47在HCV诱导的脂肪变性中发挥作用。我们通过microRNA芯片及定量PCR技术确定了HCV核心抗原3a和1b的microRNA表达谱及二者差异表达microRNA，通过分析预测差异表达microRNA的靶基因及其功能和所属通路，确定了HCV核心抗原3a和1b可以诱导肝细胞脂肪变性，同时发现一些脂肪代谢和转运的关键蛋白（ACSL1、ACSL4、ACSL6、ABCA1、ABCC1、FABP2等）在这其中可能发挥作用。通过分析HCV核心抗原3a和1b对肝细胞脂滴表面蛋白PAT家族成员在肝细胞中表达的影响，明确了TIP47在HCV诱导的肝细胞脂肪变性过程中表达升高，可能与HCV诱导的肝细胞脂滴生成相关。3. TIP47可以与微管相作用介导肝细胞内甘油三酯（triglyceride，TG）从内质网（endoplasmic reticulum，ER）到脂滴的转运。抑制小鼠AML12肝细胞系TIP47的表达使细胞内脂滴变小变少，储存在脂滴内的TG减少，在肝细胞内TG总量未发生明显变化的情况下，内质网扩张并且TG储集增多。在油酸诱导肝细胞脂滴形成过程中，TIP47从ER逐渐聚集到脂滴表面。综上所述，TIP47可以介导TG从ER到脂滴的转运。随后，通过间接免疫荧光实验，我们发现TIP47蛋白在有或无油酸刺激脂滴形成时，均与微管蛋白α-tubulin存在共定位，因此，TIP47介导TG从ER到脂滴的转运可能与微管相关。结论：本研究中，我们成功制备敏感特异的兔抗小鼠TIP47多克隆抗体。利用该抗体发现TIP47在NAFLD及HCV核心抗原诱导的肝脂肪变中显著升高。首次通过microRNA芯片确定了HCV核心抗原3a和1b的microRNA表达谱及二者差异表达microRNA，并预测其靶基因，确定了一些关键microRNA和蛋白（包括TIP47）在HCV核心抗原诱导肝脂肪变中发挥作用。首次发现TIP47可以与微管相作用介导肝细胞内甘油三酯从内质网到脂滴的转运，促进脂滴生成。