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研究目的短QT综合征（Short QT syndrome,SQTs）是一种极其罕见,异源基因遗传的心脏离子通道病,该病以心电图上QT间期、心室及心房不应期的明显缩短为主要临床特征,同时可以引起恶性心律失常而导致心源性猝死的发生。SQTs具有家族遗传性,其发病机制尚不明确,在临床上缺少特效药物,严重危害患者健康。现已有6种SQTs亚型被发现,其中1型、2型及3型均与钾离子通道的功能性改变有关。KCNH2（Potassium voltage-gated channel subfamily H member 2）基因是最早被确认的致病基因的突变位点,但还没有较为完整的研究去阐述为何KCNH2突变会引发SQTs,目前仍未发现针对此种位点突变的有效治疗药物。因此,基于之前的研究及文献报道,本课题的研究目的是建立SQTs病人特异性的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSCs）模型研究疾病的发病机制,并通过i PSCs衍生的心肌细胞进行靶向药物的筛选。研究方法本课题成功入组了1例携带KCNH2 T618I位点突变的SQTs患者以及2例健康受试者,并建立了SQTs病人特异性i PSCs及健康受试者的正常i PSCs,同时获得了病人特异性的i PSCs衍生的心肌细胞（induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,i PSCs-CMs）;为了后续实验中采用更为严格的对照,本研究应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在SQTs患者的i PSCs水平上进行T618I突变的定点校正,期望得到与患者的突变基因相同位点的等位正常基因i PSCs。基于三组i PSCs采用以下研究方法:1)通过详细比较健康受试组（正常组）、SQTs患者（病人组）及等位基因校正组（校正组）的功能学差异,如细胞形态学,电生理特征等,揭示了病人组心肌细胞的功能学表型,从而建立SQTs疾病模型;2)详细检测病人组的离子通道改变,包括动作电位（Action potential,AP）及钾离子、钠离子及钙离子通道的检测,进一步研究疾病的发病机制;3)通过分子学实验方法,检测分子水平上三组的蛋白表达是否具有改变,从而解释离子通道的改变;4)通过转录组测序分析（RNA-Seq analysis）找到与SQTs疾病产生相关的位点基因,从而确定离子通道的改变是否与基因的改变有关;5)基于对临床治疗SQTs常用药物的实验室检测结果,通过应用病人特异性的i PSCs-CMs进行靶向药物的筛选。研究结果在获得了SQTs患者皮肤样本后,应用体细胞重编程技术建立了正常组及病人组的i PSCs,同时应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对病人组的i PSCs进行T618I突变的定点校正,从而得到校正组i PSCs。基于对三组i PSCs的研究,获得以下结果:1)应用i PSCs特异性标志物SOX2、NANOG、OCT4及SSEA4进行免疫染色,结果显示三组i PSCs均有明显干性。2)应用小分子化合物的定向分化方法,将对照组、病人组及校正组i PSCs分化为心肌细胞,再应用心肌细胞的特异性标志物TNNT2和α-actinin进行心肌细胞的免疫染色;应用心室肌细胞特异性标志物MLC2v和心房肌细胞特异性标志物MLC2a对三组心肌细胞进行免疫染色,结果显示,在不同组中细胞的大小、心室及心房肌细胞的比例以及肌丝纹理排列并无显著性差异。3)应用全细胞膜片钳技术分别对三组i PSCs-CMs的动作电位进行检测,结果显示与正常组和校正组相比,病人组的心肌细胞表现出明显的心律不齐、心率加快,动作电位时程（AP duration,APD）显著缩短;同时为了确定在病人组i PSCs-CMs中发现的异常动作电位表型是否是由KCNH2突变引起的功能性增强所致,应用特异性钾离子通道激动剂PD-118057进行对照组i PSCs-CMs的瞬时加药实验,对照组i PSCs-CMs的APD缩短程度与病人组i PSCs-CMs相似。4)应用全细胞膜片钳技术分别对校正组和病人组i PSCs-CMs的钾离子、钠离子和钙离子通道进行检测,结果显示快激活延迟整流钾电流(IKr)和慢激活延迟整流钾电流(IKs)密度显著增大,钠离子电流和钙离子电流明显增大。5)应用膜蛋白表达检测实验对校正组和病人组i PSCs-CMs的钾离子和钠离子的膜蛋白表达进行检测,结果显示病人组的钾离子（KCNH2）和钠离子的膜蛋白表达明显增加,说明钾电流和钠电流的改变可能与膜蛋白的改变有关。6)应用实时荧光定量PCR（q PCR）技术和RNA-Seq分析对校正组和病人组的14个可能影响离子通道表达改变的基因进行m RNA水平的检测,结果显示影响钾离子、钠离子和钙离子通达表达的多个基因均有明显的变化,这与之前的电生理及膜蛋白检测的实验结果相吻合。7)应用全细胞膜片钳技术对病人组i PSCs-CMs进行奎尼丁和短肽蝎毒素Bm KKx2的瞬时加药实验,结果显示奎尼丁和短肽蝎毒素Bm KKx2可以有效的延长病人组的APD;应用分子学实验技术构建KCNH2突变质粒和T618I特异位点突变质粒,并对HEK 293细胞系进行瞬时转染后,应用全细胞膜片钳技术记录记录两组细胞的IKr电流,并对T618I特异位点突变组进行短肽蝎毒素Bm KKx2的瞬时加药实验,结果显示Bm KKx2可以显著增加其电流密度,因此,Bm KKx2可能是针对T618I位点突变的靶向药物。结论本研究证明,因为功能获得突变KCNH2 T618I而引起的SQTs可以由患者特异性的i PSCs-CMs体现疾病的表型,这些实验结果将有助于阐明SQTs的发病机制。同时,发现短肽毒素可以作为先导化合物,从而研发出针对SQTs的靶向药物。