腈水合酶（Nitrile Hydratase，简称NHase，EC4.2.1.84）是一种能够催化腈类化合物水合成相应的更具应用价值的酰胺类化合物的金属酶，在工业上主要用于丙烯酰胺和烟酰胺的生产。依据活性中心的金属离子种类可将其分为两种类型：含铁型腈水合酶（Fe-NHase）和含钴型腈水合酶（Co-NHase）。Rhodococcus rhodochrous J1是丙烯酰胺生产的第三代菌株，其含有两种类型的Co-NHase：高分子量腈水合酶（H-NHase）和低分子量腈水合酶（L-NHase），L-NHase的基因为nhlBAE。目前，H-NHase重组于R.rhodochrous ATCC12674后实现了过量表达，而L-NHase在宿主菌R. fascians DSM43985中实现了过量表达。这两个宿主都属于红球菌属，其表达体系存在载体构建程序繁琐、诱导表达时间过长、纯化步骤繁琐等问题，限制了对该菌株中的腈水合酶的进一步研究。大肠杆菌表达系统具有操作简单，培养时间短等一系列优势，但该菌的腈水合酶在大肠杆菌表达系统中从未实现成功表达。本研究针对该问题，通过把L-NHase的α亚基基因前较弱的核糖体结合位点（AAACGAG）替换成较强的核糖体结合位点（AAGGA），并缩短β亚基基因和α亚基基因的间隔序列为9bp（GATATAGAT），构建了重组表达载体pET24a-nhlBrbsAE，实现了L-NHase及其调控蛋白NhlE的成功表达。通过在L-NHase的α亚基基因和调控蛋白NhlE基因间增加一个强核糖体结合位点（AAGGA）并添加9bp间隔序列（GATATAGAT），构建了重组表达载体pET24a-nhlBrbsArbsE，进一步提高了L-NHase的调控蛋白NhlE的表达水平。由此，实现了L-NHase及其调控蛋白NhlE在E. coliBL21(DE3)中的活性表达。并优化了诱导温度、诱导时间、诱导剂（IPTG）浓度对L-NHase表达水平的影响，Co2+浓度对酶活性的影响以及乙醇浓度对L-NHase可溶性的影响。结果表明，最佳表达条件为：TB培养基中加入4%（v/v）乙醇，37℃培养菌体浓度（OD600）到1.0时，加入终浓度为0.1g/LCoCl2·6H2O，0.6mmol/L IPTG，24℃下诱导表达24h。最终得到的重组蛋白粗酶液的活性为109.9±5.5U/mg。针对L-NHase纯化过程繁琐这一问题，通过将Strep-tag融合在β亚基的C端，我们构建了pET24a-nhl(B-strep)rbsArbsE，同样将Strep-tag融合在调控蛋白NhlE的N端，我们构建了pET24a-nhlArbs(strep-E)，借助Strep-tag/Strep-Tactin亲和层析，实现了L-NHase及调控蛋白NhlE的一步纯化，纯酶的比酶活为330.5±6.2U/mg，该结果与野生型L-NHase的活力相当。另外，本文通过L-NHase进行同源建模，并结合相关文献报道及序列分析选取相关位点进行定点突变，研究这些点对L-NHase的合成机理，即钴离子摄取机理以及催化功能的影响。结果显示：α亚基上α-Tyr115突变成丙氨酸后，L-NHase中钴离子最终含量降为0.045±0.01/αβ（mol/mol），调控蛋白NhlE与α亚基形成的三聚体αe2中钴离子含量降为0.047±0.03/αe2（mol/mol），说明α-Tyr115影响了αe2对钴离子的摄取，进而影响到L-NHase钴离子的摄取。我们对其余各突变位点进行了分析，结合其酶活力以及模拟结果初步推测了各位点对于酶活力影响的机制。本研究实现了R. rhodochrous J1来源的L-NHase在大肠杆菌的过量表达，简化了纯化方法，并为阐明NHase的钴离子摄取机理及酶活力影响机制提供了一定依据。同时本研究对多亚基蛋白质的异源表达具有一定的借鉴意义。