论文部分内容阅读
谷胱甘肽转移酶(GSTs,EC2.5.1.18)在植物抗逆和解毒代谢中起着重要的作用。本文利用RT-PCR从水稻中克隆到一个GST基因(OsGSTU1)。该基因全长696bp,编码231个氨基酸,预测蛋白分子量25.87 kDa。对该基因在水稻中的表达模式,编码蛋白的结构与功能进行了详细研究,其主要结果如下:
1、通过系统发育和结构域分析表明OsGSTU1基因属于Tau类GST。通过RT-PCR分析,发现OsGSTU1在根、茎、叶和叶鞘组织均表达,表明该基因是组成型表达基因。半定量RT-PCR分析显示在水稻根、茎、叶中,OsGSTU1在除草剂莠去津、水杨酸和双氧水的胁迫下表达上调,预示着该基因与水稻抗逆相关。
2、在大肠杆菌中表达并纯化了OsGSTU1蛋白。酶学活性测定发现OsGSTU1对底物CDNB和NBD-C1有较高的活性,分别是8.687μmol/min permg和4.066μmol/min per mg。酶动力学分析发现对底物CDNB的Km是0.35mM,预示着OsGSTU1对底物CDNB有较高的亲和力。热力学稳定型分析发现OsGSTU1在40℃时依然保持着95％以上的活性,预示着这个蛋白具有很高的热稳定性。通过非线性拟合方法,发现在OsGSTU1蛋白存在情况下,GSH的解离常数为7.47,而纯GSH溶液中GSH的解离常数是9.20,这预示OsGSTU1蛋白在催化过程中通过降低GSH的pKa来促进催化反应。
3、将OsGSTU1蛋白的第17位苯丙氨酸分别突变为酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸,将这些突变体进行原核表达、纯化获得相应的纯化蛋白。与野生型相比,突变体蛋白的酶学活性明显下降。动力学分析显示所有突变体与野生型蛋白具有相似的KmCDNB和KmGSH,说明该位点的变异对酶与底物结合没有重要影响。然而与野生型相比,突变体蛋白的kcat/KmCDNB值下降16-275倍,表明该位点在酶与底物的共轭物形成或产物释放过程中起重要作用。