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背景高血压病是严重危害人类健康的常见心血管疾病之一，动脉结构和功能的重构性变化既是高血压病血流动力学紊乱、神经体液变化和局部内分泌因素改变的适应性反应，又是高血压病发展恶化及心脑肾等其他靶器官损害的重要病理基础。因此，逆转血管重构是防治高血压及其靶器官损害的关键所在。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)是对血压进行调节的最重要内分泌因素，具有血管收缩效应的血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是RAS中的重要物质。研究表明，AngⅡ除了参与血管紧张性和醛固酮分泌调节外，还有促进核酸合成、调控某些基因表达、刺激血管增生肥厚等重要生物学功能，并且参与高血压的血管重构过程，但具体的机制尚不完全清楚。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种具有血管活性作用的多肽类生长因子。近年来的研究证实，bFGF能够诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的增殖、迁移，以及促进细胞外基质合成，并参与高血压的血管重构过程。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种含有RGD序列的分泌型糖基化磷蛋白，与细胞的粘附和迁移功能密切相关。近年来，OPN被认为是高血压血管重构过程中的关键因素之一。芩丹胶囊(Qindan Capsule，QC)是临床治疗高血压病的中药复方制剂。本研究通过对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)动脉中膜病理改变及组织超微结构的观察，以及应用荧光实时定量PCR(real-time PCR)和Western blot检测bFGF和OPN的mRNA及蛋白表达的改变，探讨芩丹胶囊逆转高血压血管重构的机制，为其临床防治高血压病血管损害提供科学依据。目的1．观察芩丹胶囊对SHR大鼠血压和血浆内皮素-1(endothelin-1，ET-1)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、AngⅡ以及局部血管组织中AngⅡ的影响，探讨芩丹胶囊的降压机制。2．观察芩丹胶囊对SHR大鼠主动脉壁形态学及超微结构的改变，以及对bFGF、OPN mRNA和蛋白的影响，探讨芩丹胶囊逆转高血压血管重构的机制。方法1．研究对象：14周龄雄性SHR大鼠40只和14周龄Wistar-Kyoto大鼠(WKY)8只。随机分为6组，每组8只：(1)WKY对照组；(2)SHR对照组；(3)SHR+牛黄降压胶囊组(SHR+NJC)；(4)SHR+卡托普利组(SHR+CAP)；(5)SHR+芩丹胶囊大剂量组(SHR+QCH)；(6)SHR+芩丹胶囊小剂量组(SHR+QCL)。SHR+NJC组给予牛黄降压胶囊200mg／(kg·d)(相当于临床用量的15倍)，SHR+CAP组给予卡托普利15mg／(kg·d)(相当于临床用量的20倍)，SHR+QCH组给予芩丹胶囊750mg／(kg·d)(相当于临床用量的15倍)，SHR+QCL组给予芩丹胶囊150mg／(kg·d)(相当于临床用量的3倍)，WKY对照组和SHR对照组分别给予等量蒸馏水。各组大鼠均灌胃给药，每日1次，连续给药12周。末次给药后禁食24h，不禁水。3％戊巴比妥钠(30mg／kg，腹腔注射)麻醉后进行后续实验。2．研究内容：(1)大鼠尾动脉收缩压测定；(2)血浆ET-1、CGRP、AngⅡ水平以及肠系膜动脉组织中AngⅡ含量测定；(3)主动脉壁病理学观察；(4)主动脉壁形态学指标检测：中膜厚度(medial thickness，MT)、管腔内径(luminal diameter，LD)、中膜厚度与内径比值(MT／LD)；(5)主动脉壁中膜胶原含量(volume fraction collagen，VFC)检测；(6)主动脉壁中膜平滑肌细胞超微结构观察；(7)实时定量RT-PCR法(Real-time Quantitative RT-PCR)检测主动脉壁bFGF、OPN mRNA表达；(8)免疫印记(Western blot)检测主动脉壁bFGF、OPN蛋白表达。结果1．各组大鼠治疗前后收缩压动态变化与14周龄正常血压对照组WKY大鼠比较，14周龄SHR各组大鼠血压已经明显升高(P＜0.01)。SHR组大鼠收缩压在实验过程中呈持续升高状态，与26周龄正常血压的WKY组相比，26周龄SHR组大鼠收缩压显著增加(P＜0.01)。从给药第2周起，SHR+NJC组、SHR+CAP组、SHR+QCH组和SHR+QCL组大鼠收缩压与SHR组相比均有下降(P均＜0.01)。给药6周后，SHR+QCH组大鼠收缩压较SHR+QCL组下降更为显著(P＜0.05或P＜0.01)。给药12周后，各给药组大鼠收缩压与SHR组相比均有明显下降(P均＜0.01)，但各组下降程度不同；其中SHR+QCL组下降程度最小，SHR+QCH组下降程度最大，两组相比差异具有显著性(P＜0.05)。26周龄SHR+NJC组和SHR+CAP组大鼠收缩压与同周龄SHR+QCH组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。2．血浆ET-1、CGRP、AngⅡ浓度比较(1)与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比，26周龄SHR组大鼠血浆ET-1浓度明显增加(P＜0.01)。各治疗组大鼠血浆ET-1浓度较SHR组均有下降，其中SHR+QCH组下降最为显著(P＜0.05)。SHR+NJC组和SHR+CAP组虽也有下降，但与SHR组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。SHR+QCH组与SHR+CAP组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)；SHR+QCH组与SHR+QCL组相比差异无显著性(P＞0.05)。(2)与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比，26周龄SHR组大鼠血浆CGRP浓度明显下降(P＜0.05)。26周龄SHR+NJC组和SHR+CAP组大鼠与SHR组大鼠相比差异无显著性(P＞0.05)。SHR+QCH组大鼠血浆CGRP浓度较SHR组明显升高(P＜0.05)，且与SHR+NJC组和SHR+CAP组相比均有显著性差异(P均＜0.05)。SHR+QCL组与SHR组相比也有较明显的升高(P＜0.05)。SHR+QCH组与SHR+QCL组相比差异无显著性(P＞0.05)。(3)与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比，26周龄SHR组大鼠血浆AngⅡ浓度无明显统计学差异(P＞0.05)。各给药组大鼠血浆AngⅡ浓度与SHR组相比均无统计学差异(P均＞0.05)。3．血管组织中AngⅡ含量比较与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比，26周龄SHR组大鼠血管组织中AngⅡ含量显著升高(P＜0.01)。SHR+NJC组与SHR组相比差异无显著性(P＞0.05)。26周龄SHR+CAP组、SHR+QCH组和SHR+QCL组大鼠血管组织中AngⅡ含量较SHR组相比显著下降(P均＜0.01)，且与SHR+NJC组相比差异具有显著性(P均＜0.01)。上述三组相比其差异无显著性(P均＞0.05)。4．主动脉壁切片光镜下HE染色观察对照组WKY大鼠胸主动脉血管壁内膜、中膜、外膜三层结构明显，均无增厚；中膜VSMC细长呈梭形，细胞核蓝染，呈同心圆状排列整齐。SHR组大鼠主动脉壁增厚，中膜VSMC排列紊乱，单位面积细胞核数量增多。SHR+NJC组、SHR+CAP组、SHR+QCH组和SHR+QCL组大鼠主动脉壁均略有增厚，中膜VSMC排列欠规则，单位面积细胞核数目略增多。5．主动脉形态学指标比较(1)与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比，26周龄SHR组大鼠主动脉MT明显增加(P＜0.01)。与SHR组相比，SHR+NJC组大鼠主动脉MT略有下降(P＜0.05)；SHR+CAP组、SHR+QCH组和SHR+QCL组则下降明显(P均＜0.01)，但三组之间差异无显著性(P均＞0.05)。(2)与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比，SHR组及各给药组大鼠主动脉LD虽有不同程度下降，但差异无显著性(P均＞0.05)。(3)与对照组WKY大鼠相比，SHR组大鼠主动脉MT／LD显著增加(P＜0.01)。与SHR组相比，SHR+NJC组大鼠主动脉MT／LD虽有下降，但差异无显著性(P＞0.05)；SHR+CAP、SHR+QCH和SHR+QCL三组MT／LD下降明显(P均＜0.05)，但三组之间差异无显著性(P均＞0.05)。6．主动脉壁切片光镜下Masson染色观察Masson染色显示，血管平滑肌细胞染色呈红色，间质胶原呈蓝绿色。正常对照组WKY大鼠管壁胶原组织分布均匀，中膜弹力纤维板排列整齐。SHR组大鼠管壁胶原成分显著增多，中膜弹力纤维板僵硬变直甚至断裂，数量减少，平滑肌细胞肥大增生明显。与SHR组相比，SHR+NJC组胶原成分未有明显变化，而SHR+CAP组、SHR+QCH组和SHR+QCL组管壁胶原成分则明显减少，中膜弹力纤维板排列较规整。7．主动脉中膜胶原面积百分比(VFC)比较与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比，26周龄SHP组大鼠主动脉中膜胶原面积百分比明显增加(P＜0.01)。与SHR组相比，SHR+NJC组大鼠中膜胶原面积百分比无明显变化(P＞0.05)；而SHR+CAP组和SHR+QCH组大鼠主动脉中膜胶原面积百分比显著减少(P均＜0.01)，SHR+QCL组也有明显减少(P＜0.05)，并且上述三组与SHR+NJC组相比差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。8．主动脉壁中膜平滑肌细胞超微结构改变对照组WKY大鼠管壁中膜平滑肌细胞呈梭形，细胞核形态规则，细胞内可见大量密斑、密体结构，线粒体形态正常，数量较少，嵴排列紧密呈Z字型，胞浆内可见少量内质网。SHR组大鼠管壁中膜平滑肌细胞明显肥大，细胞核形态不规则，胞浆内可见大量肿胀变形的线粒体，呈空泡样，且分布广泛，嵴排列紊乱或崩解，粗面内质网增多，密斑、密体等结构明显减少。SHR+NJC组管壁中膜平滑肌细胞肥大增生，胞浆内亦可见到大量呈空泡样变的线粒体，密斑密体等结构减少。SHR+CAP组、SHR+QCH组、SHR+QCL组大鼠管壁中膜平滑肌细胞形态大致正常接近WKY组，与SHR组相比，胞浆内肿胀变形的线粒体数量明显减少，密斑、密体等结构增多，内质网数量亦有减少。9．主动脉壁bFGF、OPN mRNA表达水平比较(1)bFGF mRNA表达比较：与26周龄的WKY组大鼠相比，同周龄的SHR组大鼠血管壁bFGF mRNA表达显著升高(P＜0.01)。与SHR组大鼠相比，SHR+NJC组bFGF mRNA表达差异无显著性(P＞0.05)。与SHR组相比，SHR+CAP组、SHR+QCH组、SHR+QCL组bFGF mRNA表达显著下降(P均＜0.01)，并且与SHR+NJC组相比具有显著性差异(P均＜0.01)。(2)OPN mRNA表达比较：与26周龄的WKY组大鼠相比，同周龄的SHR组大鼠血管壁OPN mRNA表达显著升高(P＜0.01)。与SHR组大鼠相比，SHR+NJC组OPN mRNA表达差异无显著性(P＞0.05)。与SHR组相比，SHR+CAP组、SHR+QCH组、SHR+QCL组OPN mRNA表达显著下降(P均＜0.01)，并且与SHR+NJC组相比具有显著性差异(P均＜0.01)，其中QCH组下降幅度最大，与SHR+QCL组相比有显著性差异(P＜0.05)。10．主动脉壁bFGF、OPN蛋白表达水平比较(1)bFGF蛋白表达比较：与26周龄的WKY组大鼠相比，同周龄的SHR组大鼠血管壁bFGF蛋白表达明显升高(P＜0.01)。与SHR组大鼠相比，SHR+NJC组表达有所下降(P＜0.05)；SHR+CAP组、SHR+QCH组、SHR+QCL组显著下降(P均＜0.01)，且下降幅度大于SHR+NJC组(P＜0.05或P＜0.01)。(2)OPN蛋白表达比较：与26周龄的WKY组大鼠相比，同周龄的SHR组大鼠血管壁OPN蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)。与SHR组相比，SHR+NJC组表达水平无显著性差异(P＞0.05)；而SHR+CAP组、SHR+QCH组、SHR+QCL组表达水平显著下降(P均＜0.01)。且上述三组与SHR+NJC组相比均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。结论1．芩丹胶囊对SHR大鼠具有显著的降压疗效，其降压机制与芩丹胶囊降低SHR大鼠血浆ET-1水平，升高CGRP水平，调节失衡的血管活性肽网络，以及降低阻力血管局部AngⅡ水平有关。2．芩丹胶囊对SHR大鼠主动脉血管重构有明显的逆转作用，其具体表现为：改善SHR大鼠主动脉壁形态学指标，降低主动脉中膜胶原含量。其机制与芩丹胶囊降低局部AngⅡ水平，抑制主动脉壁bFGF与OPN mRNA和蛋白表达有关。3．芩丹胶囊能够改善SHR大鼠主动脉中膜VSMC表型改变，抑制其由收缩表型向合成表型的转化。机制与芩丹胶囊抑制AngⅡ、bFGF和OPN对VSMC表型转化的促进作用有关。