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背景高血压病是严重危害人类健康的常见心血管疾病之一,动脉结构和功能的重构性变化既是高血压病血流动力学紊乱、神经体液变化和局部内分泌因素改变的适应性反应,又是高血压病发展恶化及心脑肾等其他靶器官损害的重要病理基础。因此,逆转血管重构是防治高血压及其靶器官损害的关键所在。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)是对血压进行调节的最重要内分泌因素,具有血管收缩效应的血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是RAS中的重要物质。研究表明,AngⅡ除了参与血管紧张性和醛固酮分泌调节外,还有促进核酸合成、调控某些基因表达、刺激血管增生肥厚等重要生物学功能,并且参与高血压的血管重构过程,但具体的机制尚不完全清楚。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种具有血管活性作用的多肽类生长因子。近年来的研究证实,bFGF能够诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的增殖、迁移,以及促进细胞外基质合成,并参与高血压的血管重构过程。骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种含有RGD序列的分泌型糖基化磷蛋白,与细胞的粘附和迁移功能密切相关。近年来,OPN被认为是高血压血管重构过程中的关键因素之一。芩丹胶囊(Qindan Capsule,QC)是临床治疗高血压病的中药复方制剂。本研究通过对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rat,SHR)动脉中膜病理改变及组织超微结构的观察,以及应用荧光实时定量PCR(real-time PCR)和Western blot检测bFGF和OPN的mRNA及蛋白表达的改变,探讨芩丹胶囊逆转高血压血管重构的机制,为其临床防治高血压病血管损害提供科学依据。目的1.观察芩丹胶囊对SHR大鼠血压和血浆内皮素-1(endothelin-1,ET-1)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、AngⅡ以及局部血管组织中AngⅡ的影响,探讨芩丹胶囊的降压机制。2.观察芩丹胶囊对SHR大鼠主动脉壁形态学及超微结构的改变,以及对bFGF、OPN mRNA和蛋白的影响,探讨芩丹胶囊逆转高血压血管重构的机制。方法1.研究对象:14周龄雄性SHR大鼠40只和14周龄Wistar-Kyoto大鼠(WKY)8只。随机分为6组,每组8只:(1)WKY对照组;(2)SHR对照组;(3)SHR+牛黄降压胶囊组(SHR+NJC);(4)SHR+卡托普利组(SHR+CAP);(5)SHR+芩丹胶囊大剂量组(SHR+QCH);(6)SHR+芩丹胶囊小剂量组(SHR+QCL)。SHR+NJC组给予牛黄降压胶囊200mg/(kg·d)(相当于临床用量的15倍),SHR+CAP组给予卡托普利15mg/(kg·d)(相当于临床用量的20倍),SHR+QCH组给予芩丹胶囊750mg/(kg·d)(相当于临床用量的15倍),SHR+QCL组给予芩丹胶囊150mg/(kg·d)(相当于临床用量的3倍),WKY对照组和SHR对照组分别给予等量蒸馏水。各组大鼠均灌胃给药,每日1次,连续给药12周。末次给药后禁食24h,不禁水。3%戊巴比妥钠(30mg/kg,腹腔注射)麻醉后进行后续实验。2.研究内容:(1)大鼠尾动脉收缩压测定;(2)血浆ET-1、CGRP、AngⅡ水平以及肠系膜动脉组织中AngⅡ含量测定;(3)主动脉壁病理学观察;(4)主动脉壁形态学指标检测:中膜厚度(medial thickness,MT)、管腔内径(luminal diameter,LD)、中膜厚度与内径比值(MT/LD);(5)主动脉壁中膜胶原含量(volume fraction collagen,VFC)检测;(6)主动脉壁中膜平滑肌细胞超微结构观察;(7)实时定量RT-PCR法(Real-time Quantitative RT-PCR)检测主动脉壁bFGF、OPN mRNA表达;(8)免疫印记(Western blot)检测主动脉壁bFGF、OPN蛋白表达。结果1.各组大鼠治疗前后收缩压动态变化与14周龄正常血压对照组WKY大鼠比较,14周龄SHR各组大鼠血压已经明显升高(P<0.01)。SHR组大鼠收缩压在实验过程中呈持续升高状态,与26周龄正常血压的WKY组相比,26周龄SHR组大鼠收缩压显著增加(P<0.01)。从给药第2周起,SHR+NJC组、SHR+CAP组、SHR+QCH组和SHR+QCL组大鼠收缩压与SHR组相比均有下降(P均<0.01)。给药6周后,SHR+QCH组大鼠收缩压较SHR+QCL组下降更为显著(P<0.05或P<0.01)。给药12周后,各给药组大鼠收缩压与SHR组相比均有明显下降(P均<0.01),但各组下降程度不同;其中SHR+QCL组下降程度最小,SHR+QCH组下降程度最大,两组相比差异具有显著性(P<0.05)。26周龄SHR+NJC组和SHR+CAP组大鼠收缩压与同周龄SHR+QCH组相比差异无统计学意义(P>0.05)。2.血浆ET-1、CGRP、AngⅡ浓度比较(1)与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比,26周龄SHR组大鼠血浆ET-1浓度明显增加(P<0.01)。各治疗组大鼠血浆ET-1浓度较SHR组均有下降,其中SHR+QCH组下降最为显著(P<0.05)。SHR+NJC组和SHR+CAP组虽也有下降,但与SHR组相比差异无统计学意义(P>0.05)。SHR+QCH组与SHR+CAP组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);SHR+QCH组与SHR+QCL组相比差异无显著性(P>0.05)。(2)与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比,26周龄SHR组大鼠血浆CGRP浓度明显下降(P<0.05)。26周龄SHR+NJC组和SHR+CAP组大鼠与SHR组大鼠相比差异无显著性(P>0.05)。SHR+QCH组大鼠血浆CGRP浓度较SHR组明显升高(P<0.05),且与SHR+NJC组和SHR+CAP组相比均有显著性差异(P均<0.05)。SHR+QCL组与SHR组相比也有较明显的升高(P<0.05)。SHR+QCH组与SHR+QCL组相比差异无显著性(P>0.05)。(3)与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比,26周龄SHR组大鼠血浆AngⅡ浓度无明显统计学差异(P>0.05)。各给药组大鼠血浆AngⅡ浓度与SHR组相比均无统计学差异(P均>0.05)。3.血管组织中AngⅡ含量比较与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比,26周龄SHR组大鼠血管组织中AngⅡ含量显著升高(P<0.01)。SHR+NJC组与SHR组相比差异无显著性(P>0.05)。26周龄SHR+CAP组、SHR+QCH组和SHR+QCL组大鼠血管组织中AngⅡ含量较SHR组相比显著下降(P均<0.01),且与SHR+NJC组相比差异具有显著性(P均<0.01)。上述三组相比其差异无显著性(P均>0.05)。4.主动脉壁切片光镜下HE染色观察对照组WKY大鼠胸主动脉血管壁内膜、中膜、外膜三层结构明显,均无增厚;中膜VSMC细长呈梭形,细胞核蓝染,呈同心圆状排列整齐。SHR组大鼠主动脉壁增厚,中膜VSMC排列紊乱,单位面积细胞核数量增多。SHR+NJC组、SHR+CAP组、SHR+QCH组和SHR+QCL组大鼠主动脉壁均略有增厚,中膜VSMC排列欠规则,单位面积细胞核数目略增多。5.主动脉形态学指标比较(1)与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比,26周龄SHR组大鼠主动脉MT明显增加(P<0.01)。与SHR组相比,SHR+NJC组大鼠主动脉MT略有下降(P<0.05);SHR+CAP组、SHR+QCH组和SHR+QCL组则下降明显(P均<0.01),但三组之间差异无显著性(P均>0.05)。(2)与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比,SHR组及各给药组大鼠主动脉LD虽有不同程度下降,但差异无显著性(P均>0.05)。(3)与对照组WKY大鼠相比,SHR组大鼠主动脉MT/LD显著增加(P<0.01)。与SHR组相比,SHR+NJC组大鼠主动脉MT/LD虽有下降,但差异无显著性(P>0.05);SHR+CAP、SHR+QCH和SHR+QCL三组MT/LD下降明显(P均<0.05),但三组之间差异无显著性(P均>0.05)。6.主动脉壁切片光镜下Masson染色观察Masson染色显示,血管平滑肌细胞染色呈红色,间质胶原呈蓝绿色。正常对照组WKY大鼠管壁胶原组织分布均匀,中膜弹力纤维板排列整齐。SHR组大鼠管壁胶原成分显著增多,中膜弹力纤维板僵硬变直甚至断裂,数量减少,平滑肌细胞肥大增生明显。与SHR组相比,SHR+NJC组胶原成分未有明显变化,而SHR+CAP组、SHR+QCH组和SHR+QCL组管壁胶原成分则明显减少,中膜弹力纤维板排列较规整。7.主动脉中膜胶原面积百分比(VFC)比较与26周龄正常血压对照组WKY大鼠相比,26周龄SHP组大鼠主动脉中膜胶原面积百分比明显增加(P<0.01)。与SHR组相比,SHR+NJC组大鼠中膜胶原面积百分比无明显变化(P>0.05);而SHR+CAP组和SHR+QCH组大鼠主动脉中膜胶原面积百分比显著减少(P均<0.01),SHR+QCL组也有明显减少(P<0.05),并且上述三组与SHR+NJC组相比差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。8.主动脉壁中膜平滑肌细胞超微结构改变对照组WKY大鼠管壁中膜平滑肌细胞呈梭形,细胞核形态规则,细胞内可见大量密斑、密体结构,线粒体形态正常,数量较少,嵴排列紧密呈Z字型,胞浆内可见少量内质网。SHR组大鼠管壁中膜平滑肌细胞明显肥大,细胞核形态不规则,胞浆内可见大量肿胀变形的线粒体,呈空泡样,且分布广泛,嵴排列紊乱或崩解,粗面内质网增多,密斑、密体等结构明显减少。SHR+NJC组管壁中膜平滑肌细胞肥大增生,胞浆内亦可见到大量呈空泡样变的线粒体,密斑密体等结构减少。SHR+CAP组、SHR+QCH组、SHR+QCL组大鼠管壁中膜平滑肌细胞形态大致正常接近WKY组,与SHR组相比,胞浆内肿胀变形的线粒体数量明显减少,密斑、密体等结构增多,内质网数量亦有减少。9.主动脉壁bFGF、OPN mRNA表达水平比较(1)bFGF mRNA表达比较:与26周龄的WKY组大鼠相比,同周龄的SHR组大鼠血管壁bFGF mRNA表达显著升高(P<0.01)。与SHR组大鼠相比,SHR+NJC组bFGF mRNA表达差异无显著性(P>0.05)。与SHR组相比,SHR+CAP组、SHR+QCH组、SHR+QCL组bFGF mRNA表达显著下降(P均<0.01),并且与SHR+NJC组相比具有显著性差异(P均<0.01)。(2)OPN mRNA表达比较:与26周龄的WKY组大鼠相比,同周龄的SHR组大鼠血管壁OPN mRNA表达显著升高(P<0.01)。与SHR组大鼠相比,SHR+NJC组OPN mRNA表达差异无显著性(P>0.05)。与SHR组相比,SHR+CAP组、SHR+QCH组、SHR+QCL组OPN mRNA表达显著下降(P均<0.01),并且与SHR+NJC组相比具有显著性差异(P均<0.01),其中QCH组下降幅度最大,与SHR+QCL组相比有显著性差异(P<0.05)。10.主动脉壁bFGF、OPN蛋白表达水平比较(1)bFGF蛋白表达比较:与26周龄的WKY组大鼠相比,同周龄的SHR组大鼠血管壁bFGF蛋白表达明显升高(P<0.01)。与SHR组大鼠相比,SHR+NJC组表达有所下降(P<0.05);SHR+CAP组、SHR+QCH组、SHR+QCL组显著下降(P均<0.01),且下降幅度大于SHR+NJC组(P<0.05或P<0.01)。(2)OPN蛋白表达比较:与26周龄的WKY组大鼠相比,同周龄的SHR组大鼠血管壁OPN蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与SHR组相比,SHR+NJC组表达水平无显著性差异(P>0.05);而SHR+CAP组、SHR+QCH组、SHR+QCL组表达水平显著下降(P均<0.01)。且上述三组与SHR+NJC组相比均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结论1.芩丹胶囊对SHR大鼠具有显著的降压疗效,其降压机制与芩丹胶囊降低SHR大鼠血浆ET-1水平,升高CGRP水平,调节失衡的血管活性肽网络,以及降低阻力血管局部AngⅡ水平有关。2.芩丹胶囊对SHR大鼠主动脉血管重构有明显的逆转作用,其具体表现为:改善SHR大鼠主动脉壁形态学指标,降低主动脉中膜胶原含量。其机制与芩丹胶囊降低局部AngⅡ水平,抑制主动脉壁bFGF与OPN mRNA和蛋白表达有关。3.芩丹胶囊能够改善SHR大鼠主动脉中膜VSMC表型改变,抑制其由收缩表型向合成表型的转化。机制与芩丹胶囊抑制AngⅡ、bFGF和OPN对VSMC表型转化的促进作用有关。