研究背景铁死亡是铁和活性氧（ROS）依赖性的一种程序性细胞死亡方式,其最主要的特征是线粒体的缩小。铁死亡与铁代谢、ROS、脂质过氧化密切相关。铁代谢紊乱可以催化羟基自由基的产生,羟基自由基是ROS的一种类型,细胞内ROS堆积使细胞膜上的脂质发生过氧化导致氧化应激,氧化应激参与铁死亡的发生。铁死亡存在于多种疾病中,例如脑卒中、神经退行性疾病、癌症和肿瘤等。在本课题组前期的研究中,用透射电镜观察到脑出血后有线粒体的缩小表明在脑出血后有铁死亡现象的存在,同时脑出血后有包括Fe2+等多种损伤因素存在,铁死亡的分子机制多且复杂,关于脑出血后铁死亡的具体机制并不明确,不能为有效预防铁死亡的发生提供治疗办法。在临床上脑内出血最常发生的部位是基底节,研究基底节出血后的损伤机制可以为临床研究提供一些基础参考作用。本研究将氯化亚铁（Fe Cl2）直接注入纹状体内来模拟临床病人脑基底节出血后Fe2+对脑组织的损伤作用来探究铁死亡可能存在的分子机制。同时Fe2+也具有很强的神经毒性作用,Fe Cl2对脑组织中的神经元、髓鞘、突触、小胶质细胞以及紧密连接的超微结构的损害作用报道极少,对脑组织中超微结构的观察可以加深对神经系统疾病的认识。研究目的:（1）构建小鼠纹状体FeCl2脑损伤模型,明确FeCl2周围组织形态学变化。（2）探究FeCl2诱导神经元铁死亡的现象以及可能存在的分子机制。（3）观察FeCl2对一些脑组织超微结构的影响作用。研究方法:（1）构建小鼠纹状体注射FeCl2的脑损伤模型,用行为学和脑组织病理变化评价模型是否成功建立。把小鼠随机分为Sham组（注射生理盐水）和FeCl2组（注射由生理盐水配制成的FeCl2溶液）,用微量注射器在小鼠左侧纹状体定位注射FeCl2溶液或生理盐水来构建FeCl2的脑损伤模型。通过Perl’s染色验证FeCl2注射到纹状体部位。在术前1天和术后第1、3、5、7、14天检测两组小鼠的神经功能评分,前肢放置实验和转角实验来评估行为学的变化。用脑水含量的指标检测Sham组和FeCl2组在造模后脑水含量的变化。LFB/CV染色来观察造模后纹状体组织的损伤程度,FeCl2周围脑组织的脱髓鞘情况和尼氏体变化。（2）观察脑纹状体中注射FeCl2后可能引起神经元铁死亡的分子机制。用DCFH-DA染色检测ROS的生成情况、FJC染色来明确FeCl2周围组织神经元的变性情况,用透射电镜观察定量分析超微结构下神经元中线粒体形态的改变。用RT-PCR法检测Sham组和FeCl2组在术后3h、D1和D3后与铁死亡相关基因的m RNA水平和氧化还原相关基因的m RNA水平以及与铁死亡和氧化还原相关蛋白质水平的变化,包括GPX4、TFR1、SOD1、CAT、HO-1、Nrf2、Keap1和NQO1等。采用免疫印迹（Western blotting,WB）的实验方法检测造模后与铁死亡相关的TFR1、HO-1等蛋白质水平的表达变化。（3）观察FeCl2对其他脑组织超微结构的损伤。在透射电镜下观察分析Sham组和FeCl2组在造模后D1和D3髓鞘板层崩解程度、突触前后膜的变化、小胶质细胞是否有激活情况、紧密连接的紧密程度和糖原颗粒的变化。研究结果:（1）成功构建FeCl2的脑损伤模型。Sham组中无棕褐色颗粒的出现,注射FeCl2后D1和D3的脑组织中有大量的棕褐色颗粒的存在表明FeCl2组中铁离子沉积显著增多,证明FeCl2准确注射到纹状体。神经功能在造模后D1直D14都有显著缺损（n=14,P＜0.05）,且在造模D1神经功能缺损评分最高,脑损伤最严重。在前肢放置实验中,造模后小鼠对侧前肢功能损伤（n=12,P＜0.05）。转角实验中,检测到小鼠的感觉运动神经功能受损（n=14,P＜0.05）。在造模后的D1和D3,FeCl2注射的纹状体区域有明显损伤,髓鞘显著减少,尼氏体受损皱缩深染。通过行为学和相关的形态学染色表明成功构建了FeCl2的脑损伤模型。（2）注射FeCl2后使脑组织中ROS生成、神经元变性以及神经元中线粒体缩小表明有铁死亡的现象。在FeCl2组中,纹状体脑组织内有大量ROS的生成,注射FeCl2后D1和D3超氧化物的荧光强度均显著增强（n=3,P＜0.05）。注射FeCl2后周围脑组织中FJC阳性的细胞数显著增多,表明变性损伤的神经元数量明显增加（n=6,P＜0.05）。在透射电镜下观察到,FeCl2组神经元中线粒体缩小,在注射FeCl2后D1线粒体面积较小的比例显著增加（n=3）,这些现象表明脑内注射FeCl2会诱导铁死亡。（3）RT-PCR法检测注射FeCl2后铁死亡相关基因的m RNA水平和氧化应激相关基因的的m RNA水平和一些蛋白的水平的变化情况。RT-PCR结果显示FeCl2组中GPX4、SOD1和CAT的m RNA水平在3h后的改变没有统计学意义（n=6,P＞0.05）,在术后D1和D3的m RNA水平是显著降低的（n=6,P＜0.05）,表明造模后机体的抗氧化能力下降;TFR1的m RNA水平在术后3h开始明显下调（n=6,P＜0.05）,在D1和D3也是显著下降的（n=6,P＜0.05）,说明机体通过降低TFR1的m RNA水平来避免过多的铁离子转运到细胞内。在FeCl2组中Nrf2、HO-1的m RNA水平在术后3h、D1和D3均明显升高（n=5-6,P＜0.05）,表明此时机体在有刺激存在的情况下会上调抗氧化剂Nrf2、HO-1的m RNA水平;Keap1和NQO1的m RNA水平在3h后的改变没有统计学意义（n=4-6,P＞0.05）,在术后D1和D3表达量是明显降低的（n=6,P＜0.05）,NQO1的m RNA下降显示机体的还原水平较低。表明FeCl2可能通过诱导过度的氧化应激反应来介导铁死亡的发生。（4）用透射电镜观察发现,FeCl2组中脑组织的神经元、突触和髓鞘有不同程度的损伤;小胶质细胞被激活;紧密连接的紧密性遭到破坏呈现打开的状态;糖原颗粒增多;表明FeCl2对神经系统中脑组织的超微结构有损伤作用。研究结论:脑内注射FeCl2具有神经毒性作用,脑组织结构遭到损伤,促进ROS的生成来诱导氧化应激,使神经元中的线粒体缩小,引起铁死亡的发生。