论文部分内容阅读
背景:谷氨酰内切酶能特异性地切割与谷氨酸残基C-端结合的肽键,在生物制药及质谱检测中应用较多但来源受限,近年来随着质谱技术及抗体类药物的发展谷氨酰内切酶得到了进一步的重视。现在应用较多的谷氨酰内切酶是从金黄色葡萄球菌培养上清中提取获得的,金黄色葡萄球菌V8菌种来源的内切酶GluV8由336个氨基酸组成,包括含有68个氨基酸残基的前导肽序列以及C-端尾部由52个氨基酸残基组成的12个重复折叠的三肽结构。GluV8在金黄色葡萄球菌或枯草杆菌中进行表达的技术已较为成熟,但在大肠杆菌中表达时存在自身激活现象及目的蛋白以包涵体形式存在这两个问题,因此商业化的GluV8还未有在大肠杆菌中表达的报道。 目的:在大肠杆菌表达系统中获得以上清形式表达的有活性的重组GluV8,探究前导肽序列及 C-端尾部重复序列在GluV8发挥酶切活性中的作用,用较简单的纯化过程获得目的蛋白。 方法:去除GluV8的前导肽序列及C-端尾部的重复序列,将GluV8功能区部分对应的基因进行适当改造后,分别克隆入表达载体pGEX-4T-2、pET32a+进行融合表达,导入E.coil BL21(DE3)中诱导表达, SDS-PAGE检测蛋白表达结果,亲和层析等纯化技术对成功表达的目的蛋白进行纯化,用特异性的化学发光底物Z-Phe-Leu-Glu-pNA(L-2135)对重组 GluV8的酶切特性进行鉴定,HPLC检测方法对重组酶酶切胰岛素的位点特异性进行鉴定,LC-MS/MS检测方法对重组酶酶切CTLA4-Fc融合蛋白所得质量肽图谱、重组酶酶切抗体的位点特异性进行检测。 结果:(1)在大肠杆菌中用pGEX-4T-2表达载体获得了以可溶性形式表达的重组蛋白,目的蛋白约24KD,目的蛋白纯度为97.77％;(2)以Z-Phe-Leu-Glu-pNA(L-2135)作为底物时重组GluV8的相对活性为1568U/mg,反应的Km值、Vmax分别为0.870mmol/L和78.43 mmol/mg?min,在42℃、pH8.0时活性最强,50℃、pH10.0时仍有较高的活性;(3)HPLC检测结果表明重组酶酶切胰岛素有5个特异性峰的出现、酶切位点正确;(4)LC-MS/MS检测结果表明重组酶酶切CTLA4-Fc融合蛋白所得质量肽图谱覆盖率为100％;(5)LC-MS/MS检测结果表明重组酶酶切抗体的位点正确、具有酶切特异性。 结论:(1)在大肠杆菌中获得了以可溶性形式表达的重组蛋白;(2)对GluV8功能区部分进行了表达,证实 GluV8的前导肽序列及 C-端尾部的重复序列在其发挥酶切作用时不是必须的,去除之后不影响酶活;(3)用较简单的纯化过程获得了目的蛋白,提高了目的蛋白的得率,所得目的蛋白纯度高、酶切位点特异,可满足生物药物特别是抗体类药物蛋白结构及质量肽图谱分析对内切酶的要求,具有较高的应用前景。