帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种严重危害人类健康的神经退行性疾病。在我国,每年有近10万人被诊断为新发的PD患者。PD的病理特点包括神经元胞浆内出现特征性嗜酸包涵体——路易小体(Levy body),以及基底神经节黑质纹状体环路障碍多巴胺(DA)能神经元变性缺失。临床表现分为运动症状(静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态异常等)和非运动症状(认知障碍、睡眠障碍、排泄障碍等等)。为了进一步了解PD的发病机制及潜在的治疗靶点,本实验模拟突变型LRRK2G2019S及α-synucleinA53T的双转基因PD果蝇和小鼠模型,筛选更好的模拟PD的双转基因动物模型。对已构建的PD果蝇模型以1 μM的大豆异黄酮(soy isoflavone)给予终生干预。1 8月龄的PD小鼠以30 mg/kg灌胃(i.g.)14天,结果显示,大豆异黄酮能够改善PD果蝇的寿命,对PD果蝇和小鼠的行为学都有所改变,并且在黑质和纹状体内提高了 TH、Nrf2、GCLC表达量,降低α-synuclein、p-LRRK2、p-JNK MAPK、p-p38 MAPK表达水平,对于多巴胺转运体DAT和VMAT2并没显著增高。这些结果提示大豆异黄酮可能通过Keap1-Nrf2-ARE通路和MAPK通路有效抑制LRRK2激酶活性,降低路易氏小体的沉积,从而达到对帕金森氏疾病的神经保护作用。目的:建立PD动物模型。给予一定浓度的大豆异黄酮,观察药物对果蝇模型和小鼠模型形态和功能上的影响。进而探究大豆异黄酮改善PD的作用机制。方法:1、获得A53T/G2019S双转基因纯合子果蝇,接着使用UAS-GAL4系统获得果蝇 Elav 系列:SynA53T/Elav;、Elav/+;LRRK2G2019S/+、SynA53T/Elav;LRRK2GS2/+;TH 系列:SynA53T/+;TH/+、;LRRK2G2019S/TH、SynA53T/+;LRRK2GS2/TH。2、建立LRRK2转基因PD小鼠模型,使已表达外源基因LRRK2-G2019S的杂合小鼠相互杂交,利用PCR和测交鉴定获得纯合GS2小鼠模型。另外使GS2杂合小鼠与A53T杂合小鼠杂交,获得GS2-A53T双转基因小鼠。分别利用旷场、转棒、爬杆来评价 WT、Syn-A53T(HET)、LRRK2-G2019S(HOMO)、LRRK2-G2019S0(HET)和GS2-A53T双转基因小鼠模型的运动能力。利用WB检测模型小鼠体内与PD相关蛋白的表达水平。3、确定A53T/GS2果蝇和小鼠作为研究对象。挑取雌性果蝇分为三组,给模型果蝇分别喂食1μM的大豆异黄酮,观察其生命周期和行为学变化情况。以30mg/kg的剂量(i.g.)给药模型小鼠,检测给药前后小鼠行为学的改变。4、免疫组织化学检测小鼠黑质和纹状体TH的表达以及免疫荧光检测小鼠中脑黑质致密部的α-synuclein表达情况。并且检测与PD相关蛋白的表达水平以及Keap1-Nrf2-ARE和MAPK通路上相关蛋白的表达。结果:1、成功获得果蝇 Elav 系列:SynA53T/Elav;、Elav/+;LRRK2G2019S/+、SynA53T/Elav;LRRK2GS2/+;TH 系列:SynA53T/+;TH/+、;LRRK2G2019S/TH、SynA53T/+;LRRK2GS2/TH。并在他们的生命周期检测中发现:与对照组相比,三种模式果蝇的生命周期均缩短,其中;LRRK2G2019S/TH、SynA53T/+;LRRK2GS2/TH两种品系最为显著。抽取半数生命周期做统计,其中双转基因果蝇寿命明显缩短,运动能力在第五周和第六周的时候显著减弱。与对照组相比,全神经元表达A53T和G2019S后生命周期和运动能力均无显著的差异。2、构建 WT、Syn-A53T(HET)、LRRK2-G2019S(HOMO)、LRRK2-G2019S(HET)、GS2-A53T转基因小鼠模型,统计16个月的存活率。结果表明,A53T/G2019S双转基因小鼠出现了比其他组过早死亡的现象。另一方面,运动能力检测结果表明,与对照组相比,A53T(HET)在运动速度和跨格次数上无差异显示。与对照组相比,G2019(HOMO)组在运动速度、跨过中央区域、以及在棒时间的检测中均显著下降。A53T/G2019S组的运动速度和跨格次数以及在棒时间与WT组相比都有明显下降的趋势,其中运动速度和跨格次数呈显著下降。另外,TH含量在黑质和纹状体中A53T/G2019S组中表达最低。实验结果表明在纹状体和黑质中,p-LRRK2蛋白在G2019S HOMO和A53T/G2019S中表达最高。3、1μM大豆异黄酮作用于双转基因果蝇模型,结果表明:药物可以延长果蝇寿命,并且对于A53T;GS2果蝇的运动能力也有所改善。分析小鼠运动能力的检测,给药组双转基因小鼠的步行速度显著高于模型组,跨中央格次数的统计给药组也有升高的趋势。在转棒实验中,作用的双转基因小鼠的在棒上的时间较模型组有升高的趋势。爬杆实验中,大豆异黄酮作用的GS2;A53T小鼠的耗时与WT组以及模型组相比并无差异。4、免疫组织化学结果显示,相对于模型组,给药组的SNpc-DA有显著升高;在纹状体中,药物作用后TH的表达也有回升趋势,但并无显著差异。免疫荧光结果显示,所构建的GS2;A53T小鼠黑质致密部较WT组,出现大量的syuclein蛋白的表达,大豆异黄酮组的小鼠黑质中syuclein蛋白的表达相比GS2;A53T组小鼠显著降低。5、检测与PD相关的各种蛋白的表达情况。相比GS2;A53T组,大豆异黄酮组的TH含量显著升高,LRRK2的磷酸化程度显著降低,DAT蛋白水平加药后无显著改变,VMAT2蛋白表达水平在处理后也不能得到显著升高,较好地抑制了A53T/G2019S突变导致的Nrf2、GCLC的降低。在对MAPK通路进行探索时,在JNK信号通路中,相比WT组,GS2;A53T组的JNK磷酸化程度显著升高。相比GS2;A53T组,大豆异黄酮组的p-JNK表达显著降低,说明大豆异黄酮可能通过LRRK2和synuclein作用于JNK信号凋亡通路发挥作用。在p38信号通路中,和WT组相比,双转基因小鼠的p38磷酸化程度显著升高,在1 μM大豆异黄酮的作用下的p-p38的表达虽有下降趋势但并无显著性差异。结论:1、成功建立A53T/G2019S双转基因纯合果蝇,分别与Elav-Ga14和TH-GAL4杂交,获得特定部位表达突变基因。构建GS2/A53T双转基因杂合小鼠模型,GS2纯合转基因小鼠,确定A53T/G2019S作为我们的PD动物模型。2、大豆异黄酮显著改善了双转基因果蝇的运动能力和存活率,对PD转基因小鼠的运动能力具有改善作用。3、实验结果表明,大豆异黄酮改善了多巴胺神经元的缺失,对多巴胺的转运并没有显著作用,可能通过抑制A53T/G2019S突变导致Keap1-Nrf2-ARE通路上Nrf2、GCLC的升高和抑制p-JNK表达水平;一方面可能抑制了路易氏小体的沉积;另一方面抑制了 LRRK2激酶活性,从而减缓帕金森氏病的病理进程。