β肾上腺素能受体激动剂对肺损伤大鼠肺泡液体清除率的作用前言肺泡上皮具有阻止液体进入肺泡腔内和主动清除肺泡腔内液体的作用，是抵抗肺水肿形成的一道重要屏障。临床上多种有害因素都可以造成肺损伤，引起肺泡上皮屏障的破坏，通透性增加，出现肺水肿。但有关病理状态下肺泡上皮屏障结构和功能的变化尚缺乏深入的研究。肺泡上皮细胞钠的主动转运由钠通道（ENaC）和Na⁺-K⁺-ATP酶共同完成，即由上皮细胞的ENaC摄取Na⁺，然后经由基底膜上的Na⁺-K⁺-ATP酶将Na⁺泵至肺间质，同时伴随水的吸收。β₂肾上腺素能受体激动剂能够提高正常及肺损伤后肺泡液体清除率（alveolar fluid clearance AFC），促进肺内渗出液的吸收，而关于β₁及β₃肾上腺素能受体激动剂在病理状态下对AFC的影响却尚不清楚。为此本实验研究低氧和高氧肺损伤情况下，大鼠AFC在不同时期的变化情况，并探讨肺脏超微结构的改变和AFC变化之间的内在联系。并研究β₁及β₃肾上腺素能受体激动剂对肺损伤大鼠AFC的作用及其作用机制，旨在为治疗肺水肿提供新的思路。实验方法一、材料动物：雄性wistar大鼠（体重300-380克，由中国医科大学第二临床学院实验动物中心提供合格证号：SYXK（辽）2003-0019），透射电镜（H-600），数字式测氧仪（浙江省建德市利达仪器厂），水浴箱（上海跃进医疗器械厂GB11241-89），分光光度仪（日本岛津公司UV160A），烤箱（上海跃进医疗器械厂）。药物：β₁肾上腺素能受体激动剂地诺帕明由日本Tanabe药物有限公司惠赠，β₂肾上腺素能受体激动剂特布他林、β₃肾上腺素能受体激动剂BRL-37344、CGP-12177、β₁受体阻滞剂Atenolol、β₂受体阻滞剂ICI-118551、β₃受体阻滞剂SR-59230A、钠通道阻断剂氨氯吡咪、Na⁺-K⁺-ATP酶阻断剂哇巴因、秋水仙碱及秋水仙碱的衍生物β-光秋水仙碱、Evans蓝均购于美国Sigma公司，牛血清白蛋白购于北京舒伯伟化工仪器有限责任公司。二、方法1、大鼠动物模型的制备（1）高氧致肺损伤大鼠动物模型的制备：雄性wistar大鼠置于透明玻璃箱中（80cm×60cm×50cm），以10L／min输入氧气，当氧浓度达到90％后，持续输入氧气2-3L／min，使氧浓度维持在90％±1％，用数字式测氧仪监测箱内氧浓度。用钙石灰吸收CO₂,温度25-26℃，大鼠自由摄取食物和水。正常对照组大鼠置于室内空气中，氧浓度21.0％，饲养条件与高氧组相同。（2）低氧致肺损伤大鼠动物模型的制备：雄性wistar大鼠置于透明玻璃箱中，以10L／min输入氮气，当氧浓度达到10％后，持续输入氮气0.5-1.5L／min，使氧浓度维持在10％±1％，用数字式测氧仪监测箱内氧浓度。饲养条件与高氧组相同。2、指标测定（1）AFC的测定：将大鼠用10.0％水合氯醛0.03ml／10g体重进行腹腔麻醉，气管切开后进行气管插管。腹主动脉放血处死大鼠，将气管、肺、心脏全部取出。用保鲜膜包被后放入37℃水浴箱中孵育。通过气管导管将Evans蓝（0.15mg／ml）标记的5％白蛋白等渗生理盐水溶液以5ml／kg体重灌入大鼠气管内。并给予4ml的氧气（低氧大鼠给予氮气）以确保灌注液到达肺脏。并且持续给予100％的氧气（低氧大鼠给予100％氮气），使气道内保持7cmH₂O的气道压力，孵育1h后通过分光光度仪，在波长620nm处测定Evans蓝标记的白蛋白浓度。AFC计算公式如下：AFC=[（Vi_Vf）/Vi]×100，Vf=Vi×pi／Pf,式中Vi和Vf分别代表起始和最终肺泡液体总量，i表示灌注前，f表示孵育1h后吸出的肺泡灌洗液体积。P是Evans蓝标记的白蛋白浓度。（2）肺组织含水量测定：TLW的测定采用Noble法并加以改进，公式：TLW=（肺湿重-肺干重）／肺干重3、分组将动物随机分组，每组动物10只，共48组。（1）分别测定低氧肺损伤及高氧肺损伤大鼠总肺水量（TLW），AFC并取病理进行肺组织形态结构观察。（2）地诺帕明对低氧肺损伤大鼠AFC的作用及其作用机制：分别将不同药物灌入低氧肺损伤大鼠肺泡腔内，孵育1h后，检测灌注液白蛋白浓度，计算AFC。（3）CGP-12177和BRL-37344对高氧肺损伤大鼠AFC的作用及其作用机制：分别将不同药物灌入高氧肺损伤大鼠肺泡腔内，孵育1h后，检测灌注液白蛋白浓度，计算AFC。三、统计学处理数据以（?）±s表示，采用GraphPad Prism 4.0统计软件，多组数据比较采用ANOVA和Student-Newman-Keuls检验方法统计分析。实验结果一、病理改变1、高氧24h大鼠可见肺泡周围血管轻度扩张、淤血；毛细血管内皮细胞膜明显增厚。高氧48h大鼠可见肺泡周围血管扩张、淤血加重；肺泡Ⅱ型上皮细胞并无明显结构的变化；毛细血管内皮细胞出现损伤性改变。高氧72h大鼠可见到肺间质增宽、淤血，并有肺出血及较多水肿液形成；透射电镜可见到肺泡Ⅱ型上皮细胞结构的破坏。2、低氧48h大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞除微绒毛的倒伏，排列混乱外无明显的结构变化，至72h肺泡Ⅱ型上皮细胞出现损伤改变。二、TLW及AFC的变化情况高氧和低氧24h TLW明显高于对照组大鼠TLW,且随着高氧和低氧暴露时间的延长而增加。但是高氧24h（19.0±3.30％）、48h（16.4±3.41％）、低氧24h（18.74±3.19％）大鼠AFC与各对照组大鼠AFC比较差异并没有显著性。三、β₁受体机动剂对低氧大鼠AFC的作用地诺帕明能明显增加正常及低氧大鼠AFC，10^-5mol／L特布他林与10^-5mol／L地诺帕明对低氧48h大鼠AFC的作用比较差异没有显著性。地诺帕明增加AFC的作用能被atenolol完全抑制，不能被ICI-118551抑制。氨氯吡咪和哇巴因均能抑制地诺帕明对低氧大鼠AFC的作用。秋水仙碱能够明显抑制地诺帕明对低氧大鼠AFC的作用，秋水仙碱衍生物β-光秋水仙碱则无此作用。四、β₃受体机动剂对高氧大鼠AFC的作用10^-7mol／L至10^-4mol／L的BRL-37344能够明显升高高氧大鼠AFC，而CGP-12177只有10^-6mol／L和10^-5mol／L浓度能使高氧大鼠AFC明显升高。三种选择性β受体阻滞剂atenolol、ICI-118551、SR-59230A和CGP-12177联合作用高氧大鼠AFC的结果为16.5±2.67％，与β₃受体阻滞剂SR-59230A和CGP-121771联合作用（17.5±2.90％）比较差异没有显著性。BRL-37344对高氧大鼠AFC的作用能够被ICI-118551和SR-59230A抑制。氨氯吡咪及哇巴因能够明显抑制CGP-12177和BRL-37344对高氧大鼠AFC的作用。讨论低氧血症可以引起肺血管收缩，细胞活性物质的释放，导致肺损伤。氧气被广泛地用于治疗各种疾病引起的低氧血症，而高浓度给氧可导致氧中毒，肺脏是最易受到损伤的器官。高氧和低氧肺损伤的程度与氧气的浓度及持续的时间有关，本实验将大鼠暴露于90％和10％氧浓度。高氧和低氧24h即出现TLW增加，但AFC并没有随着总肺水量的增加而同步改变，高氧24h、48h、低氧24h大鼠AFC与对照组比较差异并没有显著性。一般如果TLW能够保持在5g／g以下，则肺泡上皮细胞液体清除功能可以维持在正常水平。这说明肺泡上皮细胞有较强的抗损伤能力。本实验结果表明吸入90％氧气48h内皮细胞出现空泡样的损伤改变，并有细胞膜的增厚，内质网的肿胀、细胞质水肿的出现，而上皮细胞除了微绒毛的排列混乱、倒伏以外，并没有明显的结构变化。说明即使内皮细胞的结构遭到破坏，出现间质性肺水肿，肺泡液体清除能力仍可以维持正常。本实验结果表明低氧48h大鼠AFC与正常对照组大鼠AFC比较显著降低，但肺泡上皮细胞的结构并无明显改变。说明肺泡上皮细胞正常的形态结构和肺泡上皮紧密连接的完整性是其保持肺泡正常清除能力的物质基础，但AFC降低时未必一定出现上皮细胞形态结构的明显变化，即肺泡上皮细胞形态学的改变晚于AFC的变化。肺泡上皮在轻、中度损伤的情况下仍对钠水具有主动转运功能，为临床上通过调节钠水转运治疗肺水肿奠定了理论基础。本实验表明β₁受体阻滞剂可以完全抑制地诺帕明对AFC的作用，而β₂受体阻滞剂对地诺帕明对AFC的作用没有影响。而且10^-5mol／L特布他林与10^-5mol／L地诺帕明的作用比较差异没有显著性。这一结果证明β₁受体和β₂受体在肺泡Ⅱ型上皮细胞的分布比例情况基本相当。本研究结果还表明将大鼠暴露于10％的氧浓度24h，AFC并没有明显变化，48h和72h AFC明显降低。β₁肾上腺素能受体激动剂能明显增加正常对照组大鼠及低氧大鼠AFC，地诺帕明能够提高低氧48h大鼠AFC至正常水平，而低氧72h大鼠AFC即使在地诺帕明的作用下仍明显低于正常。Na⁺-K⁺-ATP酶存在于细胞内，当受到特殊信号刺激时可以由细胞内微管转运系统进入到细胞膜，其作用是将细胞内的Na⁺逆浓度差泵至肺间质。生理情况下，秋水仙碱能够破坏细胞内微管转运系统的结构，从而抑制Na⁺-K⁺-ATP酶进入到细胞膜发挥作用，而β-光秋水仙碱是秋水仙碱的衍生物，它具备秋水仙碱抑制蛋白质合成等一般作用，但不能与微管系统结合使其去聚合，因此不具备秋水仙碱抑制Na⁺-K⁺-ATP酶进入到细胞膜发挥作用的功能。本实验结果表明地诺帕明对低氧大鼠AFC的作用能够被秋水仙碱明显抑制，而β-光秋水仙碱不能抑制地诺帕明对低氧大鼠AFC的作用。证明地诺帕明提高AFC的作用可能与其促进Na⁺-K⁺-ATP酶从细胞内向细胞膜的转运有关。关于地诺帕明和秋水仙碱对钠通道及水通道的作用还有待更深入的研究。虽然CGP-12177和BRL-37344都是β₃肾上腺素能受体激动剂，但BRL-37344从10^-7mol／L到10^-4mol／L均有明显作用，而CGP-12177只有在10^-6mol／L和10^-5mol／L浓度才能发挥明显作用。说明CGP-12177升高AFC的作用与BRL-37344比较是有一定限度的。ICI-118551和SR-59230A能够明显抑制BRL-37344的作用，三种选择性β受体阻滞剂阿替洛尔、ICI-118551、SR-59230A联合作用与选择性B3受体阻滞剂SR-59230A对CGP-12177的抑制作用比较差异没有显著性。说明BRL-37344提高AFC可能是通过β₂和β₃肾上腺素能两种受体起作用的，而CGP-12177提高AFC主要是通过β₃肾上腺素能受体起作用的。因而CGP-12177是高选择性β₃肾上腺素能受体激动剂，而BRL-37344具备β₂和β₃两种肾上腺素能受体激动剂的作用。BRL-37344和CGP-12177提高AFC的作用能够被氨氯吡咪和哇巴因所抑制，说明β₃肾上腺素能受体激动剂通过调节肺泡上皮钠主动转运机能，促进Na⁺泵至肺间质，加速肺水肿液的吸收。β₃肾上腺素能受体激动剂提高肺损伤大鼠AFC的作用是确切的。但β₃肾上腺素能受体在不同种属的动物体内的分布是不同的，而且即使是同种属的动物各个器官的分布也有明显的差异。本实验在离体的情况下研究肺泡液体清除能力是由于在肺循环缺如1h内肺泡上皮对于蛋白与钠离子的运输以及肺泡液体的清除率都保持恒定，与在体的模型比较没有显著的差异，而且不受给氧浓度等因素的影响。离体模型因为没有肺循环的参与也在某些方面存在优势，因为没有血液的灌流，减少了在肺损伤时大量蛋白液的流入，使得该模型可以更好地评价肺泡上皮通透和运输的能力。β肾上腺素能受体激动剂主要是通过调节肺损伤大鼠肺泡液体清除能力，减轻肺水肿，为临床上治疗肺水肿提供更多的选择方法!结论1、轻度肺水肿时，虽然总肺水量增加，但肺泡液体清除率可以不降低。毛细血管内皮细胞比肺泡上皮细胞更容易受到损伤。肺泡液体清除率降低时未必一定出现肺泡上皮细胞形态结构的明显变化。2、β₁肾上腺素能受体激动剂地诺帕明可以提高肺损伤大鼠的肺泡液体清除率。地诺帕明提高AFC的作用可能与其促进Na⁺-K⁺-ATP酶从细胞内向细胞膜的转运有关。β₁肾上腺素能受体激动剂为肺水肿的治疗提供了更多的选择。3、β₃肾上腺素能受体激动剂CGP-12177和BRL-37344可以提高肺损伤大鼠的肺泡液体清除率。CGP-12177是高选择性β₃肾上腺素能受体激动剂，而BRL-37344兼具激活β₂和β₃两种肾上腺素能受体的功能。β₃肾上腺素能受体激动剂为肺水肿的治疗提供了更多的选择。