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本论文利用二步酶解法制备鱼鳞明胶抗氧化肽,通过响应面试验确定最优的二步酶解工艺,探究经最优工艺制备的水解物(ATHs)对过氧化氢(H2O2)介导的氧化损伤Hep G2细胞的保护作用,通过Nano-LC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS和De novo测序法鉴定ATHs中多肽的结构,并进一步筛选出活性较强的抗氧化肽。本论文可为鱼鳞明胶抗氧化肽的开发与应用提供理论指导。(1)以草鱼鱼鳞为原料提取鱼明胶,通过碱性蛋白酶进行第一步酶解,胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分别进行第二步酶解制备鱼鳞明胶抗氧化肽,结果表明二步酶解法能有效提高水解度,增大可溶性蛋白的含量,降低水解物的分子量。碱性蛋白酶-胰蛋白酶水解物具有较强的抗氧化能力,1mg/m L碱性蛋白酶-胰蛋白酶水解物的DPPH·、·OH、O2-·清除率分别是16.98%、92.28%和43.11%,Fe2+螯合率是63.26%,其·OH清除率和Fe2+螯合率均高于同浓度的BHT(分别是60.48%和49.57%),具有替代人工合成抗氧化剂的应用前景。(2)采用单因素试验分别探究胰蛋白酶第二步酶解的时间、温度、底物浓度和p H值对碱性蛋白酶-胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率及组分IV的相对含量的影响。通过响应面试验优化确定碱性蛋白酶-胰蛋白酶二步酶解的最优工艺条件为:底物浓度100 mg/m L、p H值7.8、酶解温度53°C、时间50 min。根据最优工艺制备的ATHs的Fe2+螯合率为65.72%,组分IV的相对含量为53.36%,清除DPPH·、·OH和O2-·的IC50值分别是7.39 mg/m L、0.68 mg/m L和1.84 mg/m L。(3)以800μM的H2O2培养2 h建立氧化损伤Hep G2细胞模型,通过MTT法和流式细胞仪分别检测Hep G2细胞的存活率和凋亡率,结果表明0.19~3.00mg/m L的ATHs预先处理24 h可明显提高Hep G2细胞的存活率,降低其凋亡率。ATHs可保护Hep G2细胞抵御H2O2介导的氧化损伤,这主要归因于ATHs可提高Hep G2细胞内抗氧化酶(SOD、CAT和GPX)的活力从而降低Hep G2细胞内ROS水平、MDA含量和DNA的损伤程度。在所选的浓度范围内,0.19mg/m L的ATHs对H2O2介导的氧化损伤Hep G2细胞的保护作用最明显。(4)通过Nano-LC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS和De novo测序法鉴定ATHs中31条ALC>99%的多肽的结构,从中选择9条多肽进行合成。在9条合成的多肽中,YGPR和LLGFDNVR具有较强的·OH清除能力,2.5 mg/m L YGPR和LLGFDNVR的·OH清除率分别是34.97%和33.11%。VGPS和FPFLR具有较强的Fe2+螯合能力,2.5 mg/m L VGPS和FPFLR的Fe2+螯合率分别是16.04%和25.74%。SGLDGAK兼具较强的·OH清除能力和Fe2+螯合能力,2.5 mg/m L SGLDGAK的·OH清除率和Fe2+螯合率分别是33.11%和14.97%。合成的9条多肽的·OH清除能力和Fe2+螯合能力均低于ATHs,这可能是由于多肽之间存在相互作用。