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在众多的疟疾疫苗后选抗原中，恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原1(apical membrane antigen-1, AMA-1)和裂殖子主要表面蛋白(merozoite surface protein 1,MSP1)是两个最重要的红内期疟疾疫苗候选抗原。 AMA-1膜外区含有16个保守的半胱氨酸残基，形成3个二硫键连接的区域，其中区域III[AMA-1（III）]在序列上非常保守，推测新入侵的裂殖子仍带有该区域序列，可能参与裂殖子入侵。该蛋白膜外区（ectodomain）的免疫血清能抑制疟原虫体外生长。而MSP1是主要裂殖子表面蛋白，它在裂体增殖时合成。由于它位于裂殖子表面，故MSP1可能作为入侵受体参与裂殖子的入侵过程。许多实验证实MSP1能诱导出很强的疟疾保护性免疫，被认为是当今领先的疟疾疫苗候选抗原。而大量试验证实，MSP1各酶解片段中，仅 19KD C-末端片段（MSP1-19）随裂殖子侵入红细胞，是该抗原保护性免疫的功能域。因此，本研究以AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19为主要靶抗原，选用酵母偏爱的密码子，将AMA-1（Ⅲ）和氨基酸序列逆转录成DNA序列，产生AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19合成基因，并在毕赤氏酵母中成功地克隆并表达出AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19抗原蛋白。目 的 构建毕氏酶母表达AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19合成基因工程菌株。利用毕赤氏酵母高效表达系统表达并纯化恶性疟原虫AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19重组蛋白。表达产物将用于AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19重组蛋白下游研究及疫苗有效性试验。 材料与方法 本研究共分两大部分：1.恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原第Ⅲ亚区AMA-1（Ⅲ）在毕赤氏酵母系统中的表达与纯化；2.恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1 C末端19kDa片段（MSP1-19）在毕赤氏酵母系统中的表达与纯化。首先利用PCR技术从本室人工全合成的融合基因重组质粒pPF4/PFCP-2中扩增出AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19基因。扩增片段分别插入pPF4、pPIC9载体中，利用全自动DNA测序仪鉴定序列的正确性。将测序正确的AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19基因插入毕赤氏酵母分泌型表达载体pPIC9K中。以BglⅡ酶切重组质粒使质粒线性化，用高压电穿孔转化法将目的基因<WP=5>转化入酵母感受态细胞GS115。 用RDB平板筛选HIS+ Muts 转化子后，以不同浓度的G418加压筛选高拷贝转化子。用PCR方法检测目的基因的插入，以甲醇对阳性克隆进行诱导表达。表达产物用SDS-PAGE和免疫印迹进行检测。应用1升三角烧瓶进行大规模培养，收集培养上清透析后，应用Ni-NTA柱进行纯化获得AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19蛋白。SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的相对分子量，免疫印迹鉴定融合蛋白的特异性。 结 果 1.利用PCR技术，从人工全合成的融合基因重组质粒pPF4/PFCP-2中扩增出了AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19基因。将特异性扩增片段分别连接入pPF4、pPIC9载体中，酶切鉴定获得重组载体命名为pPF4/AMA-1（Ⅲ）、pPIC9/ AMA-1（Ⅲ）、pPF4/ MSP1-19、pPIC9/ MSP1-19。序列测定结果表明，两基因序列与实际一致。将上述基因插入pPIC9K载体中，构建了分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9K/ AMA-1（Ⅲ）和 pPIC9K/ MSP1-19。利用高压电穿孔法转化GS115宿主菌，RDB平板和G418筛选获得高拷贝转化子。甲醇诱导表达后，SDS-PAGE检测AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19蛋白均表达于培养上清，蛋白的相对分子量分别为16.3kDa和12.5 kDa。免疫印迹结果表明AMA-1（Ⅲ）基因表达蛋白能被抗AMA-1（Ⅲ）的单抗和多抗所识别，在分子量约16kDa、32kDa、48kDa、60 kDa、72 kDa 左右均出现特异条带，MSP1-19基因表达蛋白亦能被抗MSP1的单抗识别，在分子量12kDa、24kDa、36kDa、48kDa、60kDa左右出现特异条带，因为酵母表达产物形成二聚体或多聚体而出现分子量大小不同的条带。PCR鉴定结果表明，AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19基因均已整合到酵母染色体基因组中。利用1升三角烧瓶进行诱导表达后，收集各培养上清浓缩后利用Ni-NTA（6XHis）柱进行纯化，分别获得250mg左右的AMA-1（Ⅲ）和200mg左右的MSP1-19纯化蛋白，推算AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19蛋白的表达量分别为0.8g/L和1g/L。免疫印迹显示两基因表达产物能与具有空间构象的特异单抗反应，表明AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19重组蛋白在结构上接近天然蛋白。 结 论 利用PCR技术成功克隆了恶性疟AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19基因。将两基因插入pPIC9K中，构建成功pPIC9K/ AMA-1（Ⅲ）和pPIC9K/ MSP1-19分泌型毕赤酵母表达载体，转化GS115并在GS115酵母细胞中获得高水平表达。经批量培养和Ni-NTA柱纯化获得高纯度的AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19蛋白。AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19编码蛋白均分泌到培养上清表达水平分别为0.8g/L和1g/L。重组蛋白在结构上接近天然蛋白。<WP=6> 总之，我们不仅利用分子生物学技术克隆了恶性疟AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19基因。在毕赤酵母表达系统中进行了两基因的高效分泌表达、大批量培养、表达产物的纯化等方面的研究。酵母系统具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译后加工如二硫键形成等机制。在酵母细胞表达系统中可制备到一定量且在构象方面接近天然蛋白的AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19重组蛋白。本研究构建的AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19毕赤氏酵母表达菌株为我们将要进行的AMA-1（Ⅲ）和MSP1-19重组蛋白下游研究及疫苗有效性试验提供了重要基础。