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猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是引起猪地方性肺炎的主要病原体。该病导致猪生产性能下降，并增加由继发感染引起的死亡率，因而对养猪业造成巨大的经济损失。Mhp对呼吸道上皮细胞的黏附是感染发生的关键步骤。P97是猪肺炎支原体一种重要的黏附蛋白，并且在支原体感染过程中发挥着重要的功能。 本研究首先利用DNaseⅠ将p97突变基因随机消化成100-250bp的DNA小片段，将这些随机小片段插入到酵母表面展示载体pCTCON-2中，获得的酵母文库的库容量为106数量级。通过对随机挑取100个单克隆进行测序分析，100个克隆中插入的突变p97随机小片段覆盖了整个p97突变基因。在这些片段中，正向插入的片段有53个，占挑取克隆数的53％;反向插入的有47个，占47％，正向和反向插入的片段比例接近于1∶1。片段随机分布，丰度均匀，片段大小主要集中在100-250bp之间，抗原肽序列在30-60aa之间。因为B细胞表位大小大部分在8-20aa之间，从该酵母库筛选出的阳性抗原肽更接近精确表位序列。因此该文库可以用于分析P97蛋白的抗原区。 利用流式细胞分选技术筛选出文库中能与天然感染Mhp的猪阳性血清结合的阳性酵母克隆，根据分选结果，将P97蛋白划分7个抗原区域。为了验证实验结果的正确性，我们首先将P97不同区域的蛋白再次展示到酵母表面，通过流式细胞仪进行分析。同时将7个抗原区蛋白进行原核表达并纯化蛋白，利用ELISA方法对各抗原区蛋白的抗原特性进行反向验证。两种分析结果表明，D6区为P97蛋白的主要抗原区，反应原性最强，其次为D2、D4抗原区蛋白，D5、D7可能存在P97蛋白的构象型表位，D1、D3抗原区的反应原性最弱。 分选后获得与血清反应较强的184号以及104号酵母克隆，为了验证两个克隆中插入的184号和104号抗原肽是否为最小的抗原表位，我们进一步分别从184短肽C端及104号短肽N端逐个缺失氨基酸，再次将其展示到酵母细胞表面，筛选得到一个长度为15个氨基酸的184D(DEKTSSQKDPSTLRA)以及一个长度为14个氨基酸的104C（GILPQPPAAKPEAA）多肽。这两个表位能与多份Mhp阳性猪血清反应，说明它们是P97上两个在宿主体内能普遍诱导抗体免疫应答的B细胞表位。 综上所述，本研究成功构建了猪肺炎支原体P97蛋白酵母随机展示文库，并利用流式细胞分选技术筛选得到P97蛋白两个抗原表位，同时鉴定到P97的主要抗原区。本研究对于研发Mhp的表位疫苗和建立特异性诊断方法具有重要意义。