光周期育性转换基因osRACD启动区功能鉴定及其编码蛋白的生化活性分析

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该研究围绕着osRACD蛋白的生化特性、osRACD基因启动区的光调节特性以及组织专一表达调节特性开展了如下几方面的工作:1.以光敏核不育农垦58S和农垦58N为实验材料,分别进行了长日照光周期和短日照光周期处理.2.将osRACD分别克隆在原核表达载体pET28a(+)和pGEX-4T上,构成重组质粒pET-osRACD和pGEM-osRACD,并分别转化给大肠杆菌BL-21(DE3)菌株.提取经IPTG诱导后的转化子菌株的蛋白质,分别通过Ni螯合的金属层析柱以及谷胱甘肽琼脂糖珠纯化,分离到纯度在90﹪以上的His-osRACD以及GST-osRACD融合蛋白.GST-osRACD经凝血酶因子切割后,最终获得了单一的osRACD蛋白质.3.通过用反向PCR技术,分离得到osRACD基因约1.4kb的启动区片段,并将经六种限制性内切酶酶切后所获的限制片段,进行凝胶阻滞检测.研究结果显示,在osRACD基因启动区中CD(-799到-686)和DX区段(-686到-431)中,可能包含有光周期应答的顺式元件.4.通过DNaseI足迹法分析osRACD启动区中的DX区段(-686~-431),结果显示一个长度21bp的序列(5TTAATTCCAACTTTCAATTCT3)是58S-SD水稻幼穗核蛋白提取物特异结合的顺式元件,我们将该元件命名为LRE.利用DNA亲和层析技术,以LRE作诱饵,目前分离得到一个特异的蛋白组分E1,它可能包含了与LRE作用的转录因子成分.SDS-PAGE及双向电泳均显示其是由多个蛋白组成的复合物.5.RT-PCR以及原位杂交分析表明,osRACD基因仅在58S-SD育性水稻的花药中特异表达,在根、茎组织中表达水平很低.通过构建了一系列含有启动区缺失片段与gus报告基因的植物表达载体,应用Northern分析和GUS荧光检测等技术分析了这些表达载体的转基因烟草中的GUS表达活性.结果证明,全长的osRACD启动区,具有调节gus基因在烟草雄蕊中特异表达的能力,而缺失了osRACD基因启动区中osDP5区段(-182~107),明显降低了gus基因在雄蕊中的表达水平.
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