亨廷顿蛋白相关蛋白1(huntingtin associated protein1, HAP1)是第一个被发现的能与亨廷顿病基因产物亨廷顿蛋白结合的蛋白质,在中枢和周围神经系统广泛表达。在大鼠和小鼠中,HAP1具有HAP1A和HAP1B两种亚型,二者区别在于羧基末端氨基酸序列不同。在人脑内,HAP1只有一种,其序列与大鼠的HAP1A相似。HAP1基因敲除小鼠脑内出现明显的神经退行性变化,并表现出生长发育和摄食障碍,且多在出生后2-3天内死亡,表明HAP1是一种十分重要的蛋白质。研究发现,神经元内的HAP1是一种连接微管马达蛋白与被转运物的衔接蛋白或相关蛋白,参与胞内运输。除了在神经系统表达外,HAP1在包括胰岛β细胞在内的分泌含氮激素的内分泌细胞中也表达。胰岛β细胞内的HAP1参与高糖刺激后的胰岛素分泌。本实验室前期研究结果表明,HAP1可以作为胰岛β细胞内微管依赖性马达蛋白及其相关蛋白p150、KLC和KIF5B与胰岛素分泌颗粒的连接蛋白,参与调控胰岛素分泌颗粒在细胞质内的微管依赖性长距离运输。然而,胰岛素分泌颗粒向细胞膜募集的微丝(microfilament)或肌动蛋白丝(actin filament)依赖性运输是肌球蛋白5a (myosin Va)介导的,是否胰岛β细胞内的HAP1也可以作为肌球蛋白5a与胰岛素分泌颗粒的连接蛋白,参与胰岛素分泌颗粒向细胞膜募集的微丝依赖性运输,进而影响胰岛素的分泌,目前未见报道。因此,本研究将探讨HAP1是否参与胰岛β细胞内胰岛素分泌颗粒的微丝依赖性募集运输,分析β细胞内HAP1与微丝马达蛋白肌球蛋白5a的关系,证明HAP1能否作为肌球蛋白5a与胰岛素分泌颗粒间的衔接蛋白,参与胰岛素分泌颗粒向细胞膜募集的微丝依赖性运输,从而揭示HAP1影响胰岛素分泌的机制。1. HAP1与胰岛素、肌球蛋白5a和肌动蛋白在β细胞内共存如果HAP1参与胰岛素分泌颗粒的微丝依赖性运输,那么在空间上HAP1应与分泌颗粒及参与分泌颗粒微丝依赖性运输的马达蛋白肌球蛋白5a之间具有密切关系。应用激光扫描共聚焦显微镜,联合免疫荧光双标技术,我们观察到HAP1在INS-1细胞的细胞质(包括细胞突起)内呈点状分布,与胰岛素颗粒具有共定位,且在细胞膜附近二者的共定位尤为明显。同时,免疫荧光双标的单细胞三维重建分析表明,HAP1与胰岛素在INS-1细胞内的共定位是真实可靠的,避免了因空间构象造成的假象；HAP1与肌球蛋白5a和肌动蛋白及肌球蛋白5a与肌动蛋白在INS-1细胞内也分别具有共定位关系。HAP1与胰岛素颗粒、肌球蛋白5a、肌动蛋白之间的定位关系提示,HAP1可能通过与胰岛素颗粒、肌球蛋白5a之间的相互作用参与胰岛素分泌颗粒的微丝依赖性运输。2.HAP1A与胰岛素分泌颗粒在细胞膜附近共同迁移HAP1A和HAP1B的区别在于二者C末端的氨基酸序列不同。为了进一步明确这两个亚型在胰岛素分泌颗粒的微丝依赖性运输中的作用,我们在INS-1细胞内瞬时共转了HAP1A-DsRed或pJRed-HAP1B与胰岛素分泌颗粒特征性膜蛋白phogrin-EGFP。激光扫描共聚焦显微镜结果显示：HAP1A-DsRed在细胞质内呈点状分布,并与phogrin-EGFP存在广泛的共定位。从时间序列延时扫描获得的动态图像显示HAP1A-DsRed与phogrin-EGFP在细胞膜附近共同迁移。相反,活细胞观察发现pJRed-HAP1B在p细胞内没有明显运动,呈弥散状态分布在整个细胞质内。为了排除质粒转染剂量及其所携带荧光标签对HAP1B蛋白表达的定位影响,我们用携带不同荧光的HAP1B在不同转染剂量下对结果进行重复,得到了HAP1B在细胞内确实是弥散分布的相同结论。这些结果表明,HAP1A亚型可能比HAP1B亚型在胰岛素分泌颗粒的运动中发挥更加重要的作用。3.沉默HAP1抑制高糖刺激后胰岛素分泌颗粒向细胞膜的募集为了为HAP1参与胰岛素或胰岛素分泌颗粒的微丝依赖性运输提供直接证据,观察了沉默胰岛β细胞系内HAP1表达水平对胰岛素分泌颗粒在细胞膜附近的定位分布和运输特性的影响：转染phogrin-EGFP质粒对INS-1细胞内的胰岛素分泌颗粒进行靶向标记,采用siRNA沉默内源性的HAP1,在激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)和全内反射荧光显微镜(TIRFM)下观察沉默HAP1后高糖刺激引起的胰岛素分泌颗粒在细胞膜附近的定位分布与胞内运输变化。LSCM下观察发现,INS-1细胞瞬时共转HAP1SiRNA质粒或对照(scramble)质粒与phogrin-EGFP后,先用低糖(1mmol/L)孵育1h,再用高糖(20mmol/L)刺激10min,与scramble组比较,siRNA组的胰岛素分泌颗粒向细胞膜的募集明显减少。对细胞膜区域和整个细胞质内的胰岛素分泌颗粒phogrin-EGFP的荧光强度进行测量,计算胞膜/胞质的比值显示,siRNA组胰岛素分泌颗粒荧光强度的胞膜/胞质的比例显著低于对照组。TIRFM能有效地观察动态范围在200nm以内的荧光标记细胞表面物质的运动,特别适合动态分析活细胞分泌颗粒向细胞膜的募集事件。用phogrin-EGFP与HAP1siRNA质粒或scramble质粒共转染INS-1细胞后,先低糖孵育1h,再高糖刺激10min,用TIRFM记录刺激前和刺激后的图像,对刺激前后单位面积内phogrin-EGFP标记的分泌颗粒分别进行计数,结果显示,高糖刺激后,siRNA组向细胞膜募集的胰岛素分泌颗粒数目显著低于scramble组。LSCM和TIRFM观察结果表明,HAP1可调控胰岛素分泌颗粒向细胞膜的募集运输。4. HAP1介导肌球蛋白5a与胰岛素分泌颗粒之间的相互作用为了明确HAP1是否通过介导肌球蛋白5a与胰岛素分泌颗粒之间的相互作用影响后者向细胞膜募集的微丝依赖性运输,首先应用免疫共沉淀实验证明了HAP1与肌球蛋白5a和胰岛素分泌颗粒之间具有相互作用。对用siRNA沉默HAP1的INS-1细胞进行免疫共沉淀分析发现,沉默HAP1可显著减弱肌球蛋白5a与胰岛素分泌颗粒特征性膜蛋白phogrin之间的结合能力,由此表明HAP1可作为胰岛β细胞内肌球蛋白5a与胰岛素分泌颗粒之间的连接蛋白介导二者之间的相互作用,沉默HAP1导致高糖刺激后胰岛素分泌颗粒向细胞膜的微丝依赖性募集减少可能是因为肌球蛋白5a与分泌颗粒之间的结合能力减弱所致。5.高糖刺激增强HAP1与肌球蛋白5a之间的相互作用并与HAP1A去磷酸化相关为了明确HAP1参与胰岛素分泌颗粒向细胞膜募集运输的作用是否与其和肌球蛋白5a的结合力增强有关,应用免疫共沉淀实验检测了高糖刺激对INS-1细胞内HAP1与肌球蛋白5a结合特性的影响。结果显示,高糖刺激INS-1细胞后,HAP1与肌球蛋白5a的结合能力明显增强。在神经细胞中,HAP1A的磷酸化能减弱其与微管马达蛋白相关蛋白p150和KLC的结合,胞内运输因此受到抑制,而HAP1去磷酸化则相反；在胰岛p细胞内,高糖刺激能增强HAP1与p150和KLC的结合,但HAP1A的磷酸化程度减弱。为了明确HAP1与肌球蛋白5a的结合能力在高糖刺激后的增强是否与HAP1A的磷酸化减弱有关,本研究进一步分析了去磷酸化突变型HAP1A(T598A)与肌球蛋白5a的结合能力。用丙氨酸(alamine, A)替换HAP1A的羧基末端PKA磷酸化位点第598位的苏氨酸(threonine, T),构建表达绿色荧光EGFP的野生型HAP1A (EGFP-HAP1A)和突变型T598A (EGFP-T598A),转染至INS-1细胞内后进行免疫共沉淀实验。结果显示,去磷酸化的HAP1A(T598A)比野生型HAP1A能结合更多肌球蛋白5a,提示高糖刺激增强HAP1与肌球蛋白5a之间的相互作用并与HAP1A去磷酸化相关。结论本研究证明HAP1可以作为胰岛β细胞内微丝依赖性马达蛋白肌球蛋白5a与胰岛素分泌颗粒之间的连接蛋白,调控胰岛素分泌颗粒向细胞膜的微丝依赖性募集运输。