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蜱是靠吸食宿主大量血液才能维持自身生存的体外寄生虫，在吸血过程中可传播多种有害病原体，严重危害人和动物健康和生命安全。蜱逃避宿主免疫反应与蜱自身分泌产生的许多生物活性分子密切相关，其中包括许多蛋白酶及酶抑制分子。半胱氨酸蛋白酶抑制分子（Cystatins）能可逆性抑制半胱氨酸蛋白酶活性，几乎在所有生物体内均有分布，可参与多种不同的生物学过程。开展对蜱Cystatins分子的研究，能更好地阐明蜱-病原体-宿主三者之间相互作用。本研究以镰形扇头蜱2个半胱氨酸蛋白酶抑制分子RHcyst-1和RHcyst-2作为研究对象，主要开展以下三方面研究。
1.RHcyst-1和RHcyst-2对树突状细胞（DCs）分化和成熟的影响。首先成功构建并高效表达了2个Cystatin分子，即RHcyst-1和RHcyst-2。为研究2个Cystatins分子对 DCs 分化的影响，通过 GMCSF/IL-4 诱导小鼠骨髓源单核细胞，同时分别加入RHcyst-1和RHcyst-2进行干预，第3天和第6天分别收集细胞，流式细胞术检测DCs分化比例。结果显示，DCs 比例在 RHcyst-1 处理后不同时间点均明显受到抑制；而RHcyst-2蛋白处理后仅在分化的第6天抑制DCs比例，在分化的第3天对其没有影响。接着，对RHcyst-1调控骨髓源单核细胞向DCs分化的可能机制进行初步探索。结果发现 RHcyst-1 干预后，在单核细胞向 DCs 分化的不同时间点，p38 和 ERK 及STAT的转录水平均发生显著变化。Western blotting检测结果显示RHcyst-1干预后第3天p38磷酸化水平明显增加，第6天p38磷酸化水平显著降低；而ERK磷酸化水平仅在分化的第6天被抑制，第3天未发生差异性变化；STAT通路中STAT3及STAT5在分化的第3天磷酸化水平被抑制，第6天磷酸化水平增加。结果表明RHcyst-1在DCs分化过程中可影响p38 MAPK及STAT通路的转录及磷酸化。
为研究2个Cystatin分子对DCs成熟的影响，经LPS刺激的同时分别加入RHcyst-1和RHcyst-2蛋白进行干预，在干预后18 h和36 h分别通过流式细胞术检测DCs的表面标记（CD40+，CD80+，CD86+和MHC-Ⅱ）的表达。结果显示相对于LPS对照组，RHcyst-1和RHcyst-2干预后DCs表面标记（CD40+，CD80+，CD86+和MHC-Ⅱ）的蛋白表达水平均无差异性变化。结果表明，RHcyst-1和RHcyst-2对DCs成熟的影响不显著。
2.RHcyst-1和RHcyst-2对激活淋巴细胞及抗体免疫反应的影响。为探究2个Cystatin分子在免疫应答的反应阶段发挥的作用，采用OVA多肽激活的DCs与T细胞共孵育，检测RHcyst-1和RHcyst-2对T细胞激活后胞内细胞因子表达水平的影响。结果发现与对照组相比，RHcyst-1处理可明显抑制T细胞中TNFα、IFNγ及IL-2的表达水平；而RHcyst-2处理组仅对细胞因子TNFα和IL-2有抑制效应，对IFNγ的表达水平无影响。为检测2个Cystatins分子对小鼠体液免疫反应的影响，2个Cystatins分子分别与OVA蛋白共同免疫小鼠，结果发现RHcyst-1和RHcyst-2对OVA刺激产生的抗体亚型和抗体滴度无影响，且 IgG2a/IgG1 比率没有变化。结果表明 RHcyst-1和RHcyst-2不影响体液免疫应答，也不影响Th1和Th2平衡。为验证RHcyst分子对CTL杀伤效应的影响，通过检测靶细胞乳酸脱氢酶（LDH）的释放，发现RHcyst-1和RHcyst-2均不会影响效应细胞对靶细胞的杀伤效率。
3.RHcyst-1分子抑瘤应用初探。根据RHcyst-1高效的蛋白酶抑制活性以及肿瘤微环境中组织蛋白酶高表达的特性，本研究选择肿瘤作为在 RHcyst-1 分子应用的初探对象，体外选择A549、HeLa、SKOV-3和B16-F10等4株肿瘤细胞系，分别用CCK-8 检测了细胞增殖活性的变化，采用细胞划痕实验和 Transwell 小室实验分别检测了RHcyst-1对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示RHcyst-1对4种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性表现出不同程度的抑制，但对正常细胞的增殖活性却无影响。体内用B16-F10模型对RHcyst-1体内抑瘤效果进行评估，结果显示RHcyst-1组肿瘤生长明显受到抑制，生存周期延长。对外周血相关细胞亚群分析发现，RHcyst-1显著降低外周血MDSCs水平，提高脾脏MDSCs水平，但对外周血和脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞无影响。通过免疫组化检测发现，RHcyst-1显著增加CD8+T淋巴细胞在肿瘤部位的浸润。为了探究RHcyst-1作用方式是特异性结合、被细胞主动摄取或作用于细胞外基质环境，采用Western blotting和间接免疫荧光实验（IFA）定位RHcyst-1在细胞的位置。结果发现RHcyst-1只存在于培养基上清中，仅作用于细胞外环境。为了验证RHcyst-1 分子进入胞内对肿瘤细胞的影响，将 RHcyst-1 分子转染肿瘤细胞，发现转染后显著抑制胞内组织蛋白酶 mRNA 水平。此外，RHcyst-1 瘤内注射也差异性地改变了肿瘤组织内部关键组织蛋白酶mRNA水平的表达。
综上所述，镰形扇头蜱源type 1型Cystatin分子RHcyst-1对宿主免疫反应具有一定的调控作用，并参与宿主免疫应答多个阶段，说明蜱源Cystatin分子具有多能性。但其type 2型Cystatin分子RHcyst-2对宿主免疫反应影响较小。RHcyst-1抑瘤特性初步应用的结果表明，蜱源多功能天然分子在生物制剂方面具有潜在的应用前景。
1.RHcyst-1和RHcyst-2对树突状细胞（DCs）分化和成熟的影响。首先成功构建并高效表达了2个Cystatin分子，即RHcyst-1和RHcyst-2。为研究2个Cystatins分子对 DCs 分化的影响，通过 GMCSF/IL-4 诱导小鼠骨髓源单核细胞，同时分别加入RHcyst-1和RHcyst-2进行干预，第3天和第6天分别收集细胞，流式细胞术检测DCs分化比例。结果显示，DCs 比例在 RHcyst-1 处理后不同时间点均明显受到抑制；而RHcyst-2蛋白处理后仅在分化的第6天抑制DCs比例，在分化的第3天对其没有影响。接着，对RHcyst-1调控骨髓源单核细胞向DCs分化的可能机制进行初步探索。结果发现 RHcyst-1 干预后，在单核细胞向 DCs 分化的不同时间点，p38 和 ERK 及STAT的转录水平均发生显著变化。Western blotting检测结果显示RHcyst-1干预后第3天p38磷酸化水平明显增加，第6天p38磷酸化水平显著降低；而ERK磷酸化水平仅在分化的第6天被抑制，第3天未发生差异性变化；STAT通路中STAT3及STAT5在分化的第3天磷酸化水平被抑制，第6天磷酸化水平增加。结果表明RHcyst-1在DCs分化过程中可影响p38 MAPK及STAT通路的转录及磷酸化。
为研究2个Cystatin分子对DCs成熟的影响，经LPS刺激的同时分别加入RHcyst-1和RHcyst-2蛋白进行干预，在干预后18 h和36 h分别通过流式细胞术检测DCs的表面标记（CD40+，CD80+，CD86+和MHC-Ⅱ）的表达。结果显示相对于LPS对照组，RHcyst-1和RHcyst-2干预后DCs表面标记（CD40+，CD80+，CD86+和MHC-Ⅱ）的蛋白表达水平均无差异性变化。结果表明，RHcyst-1和RHcyst-2对DCs成熟的影响不显著。
2.RHcyst-1和RHcyst-2对激活淋巴细胞及抗体免疫反应的影响。为探究2个Cystatin分子在免疫应答的反应阶段发挥的作用，采用OVA多肽激活的DCs与T细胞共孵育，检测RHcyst-1和RHcyst-2对T细胞激活后胞内细胞因子表达水平的影响。结果发现与对照组相比，RHcyst-1处理可明显抑制T细胞中TNFα、IFNγ及IL-2的表达水平；而RHcyst-2处理组仅对细胞因子TNFα和IL-2有抑制效应，对IFNγ的表达水平无影响。为检测2个Cystatins分子对小鼠体液免疫反应的影响，2个Cystatins分子分别与OVA蛋白共同免疫小鼠，结果发现RHcyst-1和RHcyst-2对OVA刺激产生的抗体亚型和抗体滴度无影响，且 IgG2a/IgG1 比率没有变化。结果表明 RHcyst-1和RHcyst-2不影响体液免疫应答，也不影响Th1和Th2平衡。为验证RHcyst分子对CTL杀伤效应的影响，通过检测靶细胞乳酸脱氢酶（LDH）的释放，发现RHcyst-1和RHcyst-2均不会影响效应细胞对靶细胞的杀伤效率。
3.RHcyst-1分子抑瘤应用初探。根据RHcyst-1高效的蛋白酶抑制活性以及肿瘤微环境中组织蛋白酶高表达的特性，本研究选择肿瘤作为在 RHcyst-1 分子应用的初探对象，体外选择A549、HeLa、SKOV-3和B16-F10等4株肿瘤细胞系，分别用CCK-8 检测了细胞增殖活性的变化，采用细胞划痕实验和 Transwell 小室实验分别检测了RHcyst-1对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示RHcyst-1对4种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性表现出不同程度的抑制，但对正常细胞的增殖活性却无影响。体内用B16-F10模型对RHcyst-1体内抑瘤效果进行评估，结果显示RHcyst-1组肿瘤生长明显受到抑制，生存周期延长。对外周血相关细胞亚群分析发现，RHcyst-1显著降低外周血MDSCs水平，提高脾脏MDSCs水平，但对外周血和脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞无影响。通过免疫组化检测发现，RHcyst-1显著增加CD8+T淋巴细胞在肿瘤部位的浸润。为了探究RHcyst-1作用方式是特异性结合、被细胞主动摄取或作用于细胞外基质环境，采用Western blotting和间接免疫荧光实验（IFA）定位RHcyst-1在细胞的位置。结果发现RHcyst-1只存在于培养基上清中，仅作用于细胞外环境。为了验证RHcyst-1 分子进入胞内对肿瘤细胞的影响，将 RHcyst-1 分子转染肿瘤细胞，发现转染后显著抑制胞内组织蛋白酶 mRNA 水平。此外，RHcyst-1 瘤内注射也差异性地改变了肿瘤组织内部关键组织蛋白酶mRNA水平的表达。
综上所述，镰形扇头蜱源type 1型Cystatin分子RHcyst-1对宿主免疫反应具有一定的调控作用，并参与宿主免疫应答多个阶段，说明蜱源Cystatin分子具有多能性。但其type 2型Cystatin分子RHcyst-2对宿主免疫反应影响较小。RHcyst-1抑瘤特性初步应用的结果表明，蜱源多功能天然分子在生物制剂方面具有潜在的应用前景。