论文部分内容阅读
目的:探讨大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)及缺血预适应(IPC)后,循环血中微囊泡(MV)表型及数量的变化,及I/R-MV、IPC-MV对正常和缺氧/复氧(H/R)损伤H9c2细胞的作用。方法:1.大鼠在体心肌I/R及IPC模型的建立及验证健康雄性Wistar大鼠随机分为3组:假手术组(Sham)于冠状动脉左前降支(LAD)下穿线,不予结扎;I/R组,结扎或松开LAD致心肌缺血/再灌注损伤,心肌缺血30 min/再灌注120 min;IPC组,心肌缺血5 min/再灌注5 min,循环3次,再行缺血30min/再灌注120 min。连续监测动脉收缩压、舒张压以及标准II导联心电图,2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色法测定心肌梗死面积。2.I/R-MV及IPC-MV的分离提取及表型鉴定Sham组,LAD下穿线后不予结扎,旷置45 min;I/R组,先旷置15 min,行缺血30 min后再灌注;IPC组,先旷置15 min,行缺血5 min/再灌注5 min,循环3次。三组动物均于处理后立即在腹主动脉取血,枸橼酸钠抗凝,经两步离心得到无血小板血浆(PFP)。取部分PFP用流式细胞术进行MV的表型鉴定及计数。剩余PFP经超速离心分别得到Sham-MV,I/Rst-MV和IPC-MV。3.I/Rst-MV及IPC-MV对正常培养H9c2细胞的影响H9c2细胞常规培养24h后分为正常对照(Control)、Sham MV、I/Rst MV和IPC MV 组。Control 组加入无 FBS 的 DMEM;Sham MV 组,加入 100 μg/mL的 Sham-MV;I/Rst MV 组,加入 100 μg/mL 的 I/Rst-MV;IPC MV 组,加入 100μg/mL的IPC-MV;均培养6 h。MTT法检测细胞存活率,分光光度法测定细胞培养上清中LDH活性,Hoechst33258染色观察细胞核形态,Annexin V/PI双染检测细胞凋亡率。4.I/Rst-MV及IPC-MV对H/R损伤的H9c2细胞的影响H9c2细胞常规培养24h,弃上清,分为5组:对照组(Control):加入对照液;H/R组:加入缺氧液;ShamMV + H/R组:加入含100μg/mLSham-MV的缺氧液;I/RstMV + H/R 组:加入含 100 μg/mL I/Rst-MV的缺氧液;IPCMV + H/R组:加入含100 μg/mLIPC-MV的缺氧液。除Control组常氧培养16h外,其余各组均缺氧12h,复氧4h。MTT法检测细胞存活率,Hochest 33258染色法观察细胞核形态,Annxin V/PI双染法检测细胞凋亡率,微量酶标法检测caspase 3活性,Western blot法检测H9c2细胞中p-ERK1/2蛋白表达水平。结果:1.大鼠在体心肌I/R及IPC模型的建立及验证I/R组,缺血期ST-段显著抬高;室早与室速发生率均为100%,室颤发生率为62.5%。室早出现时间为6.08±1.01 min,个数为203±87;室速出现时间为8.23±1.88min,持续时间为0.57±0.22min。梗死区与危险区比值为37.14±4.18%。与I/R组相比,IPC组VT及VF的发生率明显降低(37.5%vs.100%,P<0.01;0%vs.62.5%,P<0.01),VPC 及 VT 出现时间明显推迟(13.95±1.63 minvs.6.08± 1.01 min,P<0.001;15.51±0.77 min vs.8.23±1.88 min,P<0.001),VPC 个数明显减少(76±33 vs.203±87,P<0.01),VT 持续时间缩短(0.13±0.07 min vs.0.57±0.22 min,P<0.05);梗死范围明显缩小(18.08±3.12%vs.37.14±4.18%,P<0.001)。2.I/R-MV及IPC-MV的分离提取及表型鉴定循环血经2,600g,10min和10,000 g,5min离心后,经流式检测,1μm以下粒子信号占全部信号的99%以上。与Sham组相比,I/Rst及IPC大鼠循环血中内皮来源MV(EMV)数量无变化,但血小板MV(PMV)数量减少。I/Rst及IPC组间无差异。3.I/Rst-MV及IPC-MV对正常培养H9c2细胞的影响与Control组比较,Sham、I/Rst及IPC MV组细胞存活率均显著下降(96.24±2.28%,P<0.05;92.81±2.78%,P<0.001;91.63±2.90%,P<0.001;vs.100±0%)。与Sham MV组比较,I/Rst MV及IPC MV组细胞存活率降低,其中IPC MV组的降低具有统计学意义(91.63±2.90%vs.96.24±2.28%,P<0.001)。I/Rst MV与IPC MV组细胞存活率无差别。LDH测定结果显示,与Control组相比,Sham MV和I/Rst MV组LDH活性均有上升趋势。与Control和与Sham MV组比较,IPC MV 组 LDH 活性均显著增高(114.20±7.20 U/L vs.95.54±5.54 U/L,P<0.01;vs.96.58±6.72 U/L,P<O.01)。Hoechst33258 染色结果显示,与 Control 组相比,各MV处理组细胞核固缩凝聚均增多。与ShamMV组相比,I/Rst及IPC MV组细胞核固缩增多,但两组间无明显的差别。AnnexinV/PI双染显示,各组凋亡率无显著性差异,IPC-MV有增加H9c2细胞凋亡率的趋势。4.I/Rst-MV及IPC-MV对H/R损伤的H9c2细胞的影响与Control组比较,H/R组细胞存活率明显降低(68.15±5.76%vs.100±0%,P<0.001),细胞核固缩凝聚,呈致密浓染,细胞核分裂成碎片,凋亡率明显增高(34.37±5.16%vs.10.64±1.51%,P<0.001),caspase3 活性升高(2387.45±136.67IU vs.1482.93±86.45 IU,P<0.001)。I/Rst MV + H/R 和 IPC MV + H/R 组分别与 H/R组比较,细胞存活率显著提高(88.65±3.80%,P<0.001;86.06±1.92%vs.68.15±5.76%,P<0.001)、细胞核凝聚及细胞碎片减少、凋亡率减少(19.76±2.16%,P<0.001;20.43±3.34%vs.34.37±5.16%,P<0.001)、caspase 3 活性明显降低(1580.23±215.62 IU,P<0.01;1346.09±287.56 IU vs.2387.45±136.67 IU,P<0.001),但 I/Rst MV + H/R 和 IPC MV + H/R 两组间无统计学差异。Western blot结果显示,与H/R组相比,IPCMV + H/R组p-ERK1/2表达显著增高。结论:1.成功建立稳定可靠的大鼠在体心肌I/R及IPC动物模型。与Sham组比较,I/R-EMV及IPC-EMV数量无显著变化,I/R-PMV及IPC-PMV数量减少。2.I/Rst-MV及IPC-MV对正常培养H9c2细胞有轻度促凋亡作用。3.成功建立H12 h/R4 h诱导H9c2细胞损伤模型,细胞凋亡现象明显。I/Rst-MV及IPC-MV均能抗H/R诱导的H9c2细胞凋亡,其抗凋亡作用与抑制caspase 3活性有关。IPC-MV可上调H/R损伤的H9c2细胞中p-ERK1/2表达,提示ERK1/2通路可能参与了 IPC-MV抗H/R诱导的H9c2细胞凋亡作用。