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研究目的:观察表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor)抑制剂埃罗替尼(Erlotinib,ERL)和COX(Cyclooxygenase)抑制剂吲哚美辛(Indomethacin,IND)单独或联合应用对胰腺癌细胞生长的影响,初步探讨两药对胰腺癌细胞细胞周期改变、细胞增殖和凋亡过程的影响;以及对胰腺癌新生血管生成的调节作用,旨在阐明吲哚美辛和表皮生长因子受体抑制剂埃罗替尼单独或联用对胰腺癌生长的抑制作用及其机制。研究方法:1.MTT法检测不同浓度、不同时间IND或(和)ERL对人胰腺癌BxPC-3细胞活力和增殖的影响。2.流式细胞分析、透射电镜和TUNEL法检测用药前后细胞周期和细胞凋亡的变化。3.RT-PCR检测药物作用前后BxPC-3细胞EGFR、COX-2、VEGF、以及凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak mRNA的表达;Western blot法检测BxPC-3细胞COX-2和EGFR蛋白的表达情况。4.建立人胰腺癌细胞株BxPC-3裸鼠移植瘤模型,应用IND或(和)ERL药物干预后动态观察肿瘤的生长曲线和瘤重,计算抑瘤率。5.对移植瘤组织进行HE染色观察肿瘤形态,免疫组化法检测移植瘤组织中COX-2和EGFR的变化;免疫组化染色标记移植瘤新生血管Ⅷ因子抗原,计算肿瘤组织微血管密度(MVD)。RT-PCR法检测IND和ERL对移植瘤组织VEGF mRNA表达的影响。TUNEL法研究裸鼠移植瘤组织肿瘤细胞的凋亡。6.应用小管形成实验研究IND或(和)ERL对体外血管生成的影响。研究结果:1.IND和ERL对胰腺癌细胞的生长抑制效应随着药物剂量增加和作用时间的延长而增加,当IND联合ERL时,对细胞生长的抑制作用更为明显。2.透射电镜、流式细胞分析以及TUNEL法检测均表明IND组和ERL组细胞凋亡比例和凋亡指数(AI)明显增加;与对照组比较,IND或ERL单独用药可以使细胞阻滞于G0/G1期,而联合用药组的细胞凋亡和周期阻滞更为明显。3.应用IND及ERL干预后可见BxPC-3细胞COX-2和EGFR mRNA表达的减少,两药联用时COX-2和EGFR mRNA下调更为显著。Western blot检测各组细胞COX-2和EGFR蛋白的表达也得到相似的结果。不同浓度IND和ERL对BxPC-3细胞Bcl-2、Bcl-xl mRNA表达均有抑制作用, IND对Bax mRNA的表达影响不明显,而ERL组和联合用药组的Bax mRNA表达较对照组有轻微上调。4.胰腺癌裸鼠移植瘤体内实验中,给予ERL或(和)IND药物干预4周后,ERL组抑瘤率为74.5%,IND组抑瘤率为67%,联合组抑瘤率为82.2%。5.RT-PCR和免疫组织化学染色法显示药物干预组移植瘤组织COX-2、EGFR mRNA和蛋白表达均较对照组下调,TUNEL法显示药物干预组肿瘤凋亡细胞明显增多,凋亡指数(AI)高于对照组;ERL组和联合组裸鼠移植瘤组织bax mRNA表达上调。6.小管形成实验显示ERL和IND能抑制人脐静脉血管内皮细胞体外形成中空闭合管状结构,而联合用药组对内皮细胞小管形成抑制更为明显。ERL和(或)IND干预后移植瘤组织MVD较对照组显著下降。在体内或体外实验中,经ERL和(或)IND干预后,胰腺癌BxPC-3细胞或裸鼠移植瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达均受到显著抑制。主要结论和意义:IND和(或)ERL在体内、体外对胰腺癌的生长均呈负向调节作用,且IND和ERL对胰腺癌生长表现出协同抑制作用,提示COX-2信号与EGFR信号之间可能有交互作用。药物对肿瘤的抑制可能通过改变促凋亡基因和抑凋亡基因之间的平衡,促进胰腺癌细胞的凋亡,抑制细胞增殖,诱导胰腺癌细胞周期阻滞于G0/G1期,下调促血管生成因子VEGF的表达,抑制胰腺肿瘤新生血管的生成来实现的。提示COX-2抑制剂联合EGFR抑制剂可能是胰腺癌辅助化疗手段中及其有希望和前景的治疗策略之一。