论文部分内容阅读
锥虫是一类寄生于所有脊椎动物血液中的鞭毛类原生动物。在自然条件下,锥虫经吸血水蛭传播广泛寄生于各种海水和淡水鱼类,但鱼类锥虫的分类和系统发育关系并不清楚。本论文以中国鱼类锥虫为主要研究对象,采用形态学和分子数据相结合的方法,厘定了我国部分鱼类锥虫,研究了鱼类锥虫的分类及系统发育关系。为获得纯净的虫体用于分子系统学研究,本论文还探索了鱼类锥虫的分离技术。其主要研究结果和结论如下:
1.含锥虫黄鳝血液在pH7.4的51%Percoll分离液作用下,经2.9×103 rpm离心15 min后,除去大部分血细胞,然后通过DEAE-纤维素层析柱,获得纯化的鳝锥虫。此法具有较高的灵敏性,还可以作为鳝锥虫病诊断和流行病学研究的手段之一。
2.首次采用重组气溶素蛋白分离血液内锥虫。分离的锥虫用PGSS重悬,在4℃可存活3-4天,与未用气溶素作用的血液中锥虫存活时间相当,表明重组气溶素蛋白对锥虫没有毒害作用。
3.选用13个形态特征值对寄生乌鳢和沙塘鳢的锥虫进行了光学显微镜的形态学分析,通过与相似种比较鉴定,将这些锥虫暂定为鳢锥虫。沙塘鳢作为新记录寄主第一次被发现和报道。
4.通过光学显微镜观察了寄生牛山湖鳜鱼的锥虫。这种锥虫与前人描述的鳜锥虫具有很大的形态学相似性,暂定为鳜锥虫。选用13个形态特征值对鳜锥虫进行了形态学再描述及与相似种的比较。同时,比较了鳜锥虫与相似种18S rRNA基因序列的相似性,并在构建的分子系统系统发育树中确定了鳜锥虫的位置。
5.寄生黄颡鱼和鲤鱼的锥虫都被认为是黄颡锥虫。通过现行形态学标准分析发现,寄生牛山湖黄颡鱼的锥虫有两种形态:Trypanosoma sp Pseudobagri和T.sp,寄生鲤鱼的有一种形态T.sp Cario,而且三形态种的形态特征值差异很大。T.spCarpio与鳜锥虫不仅形态学特征十分相似,而且18S rDNA序列的相似性也极高(99.99%),在分子系统发育树中,二者聚成一枝,形成姊妹群,因此,二者可能是同一种类。T.sp Pseudobagri为第一次发现的形态种,与Marv克隆株锥虫的18SrDNA序列相似性为99.8%,在系统树中聚成姊妹群,怀疑二者可能是同一基因种。T.sp处于在系统发育树中处于鱼类锥虫枝的最底部,且与其他鱼类锥虫的18SrDNA序列差异达到3.5-5.8%,暂定为黄颡锥虫。以上结果也表明鱼类锥虫没有严格的宿主特异性。
6.利用透射电镜观察了黄颡锥虫的超微结构,发现锥虫表膜是一种三层结构的单位膜,外覆盖着一层糖蛋白的外套。鞭毛、鞭毛与身体黏附区及外周微管与其他锥虫的相似。在电镜图片中,动核、胞核、线粒体及空泡等细胞内含物均被观察到。但超微结构的异同在锥虫的进化关系研究是否具有重要意义并不确定。
7.以18S rRNA基因为分子标记进行了鱼类锥虫的系统发育分析,系统树中引入了7个我国鱼类锥虫的18S rDNA序列。所有的鱼类锥虫聚成一枝,海水鱼类锥虫与淡水鱼类锥虫形成姊妹关系。我国鱼类锥虫内分两个群。