背景急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）目前已成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。尽管冠心病治疗学取得了长足进步,但是AMI的治疗现状仍不容乐观。近年来,骨髓干细胞移植技术在心血管疾病领域的应用为AMI提供了全新的治疗策略。动物和临床研究的初步结果均证实骨髓干细胞治疗AMI安全、有效,然而由于对其治疗机制认识的不足,致使目前许多研究问题无法解决,如移植时机的选择、移植途径的选择等。进一步明确其治疗机制是推动骨髓干细胞移植技术前进的关键环节。因此在现有已知治疗机制的基础上进一步探讨潜在的未知机制是骨髓干细胞移植领域的主要研究方向之一。近年来研究发现骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）具有独特的免疫调节特性,移植到体内后可以调节受体免疫炎症反应。AMI后伴随有强烈的免疫炎症反应,其在梗死后心室重构过程中起着重要的推动作用。BMSCs移植治疗心肌梗死的机制是否也与调节梗死心脏炎症反应有关,目前并不清楚。因此,进一步明确BMSCs对心肌梗死后免疫炎症反应的影响有可能揭示BMSCs治疗心肌梗死的新机制。目的（1）探讨AMI炎症反应期内移植BMSCs对心肌梗死的治疗效果;观察其在AMI后炎症环境中存活和分化情况;并观察其对心肌梗死后早期重构的影响。（2）探讨BMSCs对AMI后病理性免疫炎症反应的影响,分别观察BMSCs移植对AMI大鼠脾脏淋巴细胞杀伤心肌细胞和心肌炎性细胞因子表达的影响。方法（一）大鼠BMSCs提取、扩增和鉴定1.BMSCs提取和扩增:取体质量120～150g健康清结级雄性SD大鼠若干只,无菌条件下取其骨髓,采用密度梯度离心和贴壁培养的方法分离BMSCs,并进行传代扩增。2.BMSCs鉴定:分别通过体外成骨和成脂肪细胞诱导分化培养以及流式细胞仪检测细胞表面抗原（CD29、CD34、CD45和CD105）表达情况,鉴定提取的骨髓细胞。（二）AMI后即刻移植BMSCs对心肌梗死的疗效观察1.BMSCs体外标记:采用BrdU标记法体外标记BMSCs。标记后检测标记阳性率,消化细胞调整密度为1x10⁷个/mL,移植备用。2.AMI模型制作和BMSCs移植:采用结扎冠状动脉前降支的方法复制大鼠AMI模型,模型制作成功即刻通过心外膜直接注射的方法将BrdU标记好的BMSCs分四点注射到梗死心肌周边部位,每点注射0.1 mL,对照组采用相同方法注射等体积的PBS缓冲溶液,同时部分大鼠开胸后仅穿线不结扎冠状动脉前降支作为假手术组。实验过程随机进行,将围手术期内死亡大鼠排除在外（认为与手术和麻醉相关）,最后每组剩余实验大鼠各8只,进入实验分析。3.心脏超声检测:分别在AMI后1天和4周末,通过心脏超声检查评价大鼠心脏功能。4.血流动力学检查:AMI后4周末,麻醉后通过右侧颈内动脉插管方法,用生理记录仪记录大鼠心脏血流动力学指标,进一步评价心脏功能。5.组织标本留取:（1）血流动力学检查完毕后,处死各组大鼠,收集心脏标本,并进行分割,部分心肌组织置-80℃低温保存,部分心肌组织采用多聚甲醛固定、石蜡包埋。（2）同时无菌条件下取出大鼠脾脏,立刻分离脾脏淋巴细胞,用于淋巴细胞杀伤效应检测实验。6.组织学染色检查:取部分心肌标本行HE染色和Masson trichrome染色,观察心肌梗死情况,测量心肌梗死面积、梗死部位室壁厚度和梗死膨胀指数。7.移植细胞存活和分化情况检测:取部分心肌标本进行抗BrdU免疫组化染色,观察移植细胞存活情况;另取部分心肌组织行抗BrdU和抗cTnI免疫荧光双染,观察移植细胞向心肌细胞的分化情况。8.梗死心脏胶原蛋白表达情况检测:分别采用RT-PCR和western blot方法测量梗死部位和非梗死部位组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达情况,进一步评价心室重构。（三）BMSCs对AMI大鼠淋巴细胞杀伤效应的影响1.脾脏淋巴细胞体外杀伤心肌细胞检测:（1）出生2天内的SD乳鼠若干只,分离出心肌细胞和非心肌细胞;（2）将提取的脾脏淋巴细胞和乳鼠心肌细胞（或非心肌细胞）体外共培养（细胞密度10:1）,采用结晶紫法检测脾脏淋巴细胞对乳鼠心肌细胞（非心肌细胞）的体外杀伤效应。2.AMI后淋巴细胞向梗死心脏浸润情况分析:取心肌组织标本,行HE染色后观察梗死区和非梗死区组织内淋巴细胞的浸润情况。（四）BMSCs对梗死心肌炎性因子表达的影响1.免疫组化染色:取部分心肌标本,分别行抗白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、IL-10和肿瘤坏死因子a（tumor necrosis factor-a,TNF-a）免疫组化染色,观察心肌组织中炎性因子的表达情况。2.炎性因子mRNA表达情况检测:取梗死周边区心肌组织,采用RT-PCR法分别检测心肌组织中IL-6、IL-10和TNF-a mRNA表达情况。3.炎性因子蛋白表达定量检测:取梗死周边区心肌组织,采用western blot法半定量检测心肌组织中IL-6、IL-10和TNF-a蛋白表达情况。4.心肌组织核因子κB活性检测:取梗死周边区心肌组织,采用western blot法检测心肌组织核因子κB活性。结果1.大鼠BMSCs提取、扩增和鉴定:通过密度梯度离心和贴壁培养方法提取的骨髓细胞具有旺盛的增殖能力;在特殊培养条件诱导下可以分化成骨细胞和脂肪细胞;流式细胞检测结果显示提取细胞高度表达CD29（80.10%）和CD105（85.20%）,低水平表达CD34（15.86%）和CD45（10.50%）。2.BMSCs移植对AMI的疗效观察:（1）BMSCs经BrdU标记后,阳性率在85%左右。（2）AMI后即刻移植的BMSCs可以在受体心脏内存活至少4周,研究中未检测到移植细胞向心肌细胞发生分化。（3）与MI+PBS组相比,MI+BMSCs组梗死面积明显缩小[（38.39±2.77）%比（45.83±3.08）%,P＜0.001],梗死区室壁厚度增加[（2.3±0.3）mm比（1.5±0.5）mm,P＜0.01],心室重构明显减轻[LVEDD（mm）:（6.45±0.47）比（7.81±0.31）,P＜0.05;心脏/体质量（mg/g）:（2.99±0.10）比（3.21±0.06）,P＜0.01;梗死膨胀指数:（1.37±0.24）比（2.20±0.22）,P＜0.001],心功能的恶化得到一定程度延缓[EF%:（30.76±3.39）比（24.06±4.71）,P＜0.05;FS%:（29.33±4.87）比（23.05±3.94）,P＜0.05;LVEDP（mmHg）:（12.35±4.87）比（19.83±4.91）,P＜0.01;+dp/dt_max（mmHg/s）:（4591.63±415.38）比（3887.75±275.62）,P＜0.01:-dp/dtmax（mmHg/s）:（4242.13±273.93）比（3480.88±346.44）,P＜0.01],但研究中未观察到心功能的明显改善。（4）BMSCs对梗死心脏胶原蛋白沉积具有双重调节作用,一方面可以促进梗死部位胶原蛋白沉积,增加梗死区室壁厚度,另一方面可以抑制非梗死区胶原蛋白的沉积。3.BMSCs移植对AMI大鼠脾脏淋巴细胞杀伤效应的影响:（1）AMI 4周末,大鼠脾脏淋巴细胞体外可以特异性杀伤乳鼠心肌细胞,BMSCs移植可以减轻大鼠脾脏淋巴细胞的杀伤效应[MI+PBS:（47.20±5.13）%,MI+BMSCs:（34.28±6.13）%,P＜0.05]。（2）AMI 4周末,梗死区和非梗死区均可以检测到淋巴细胞浸润。4.BMSCs移植对AMI大鼠心肌炎性细胞因子表达的影响:（1）AMI 4周末,心肌组织中IL-6、IL-10和TNF-a炎性细胞因子表达明显增加,同时伴随核因子κB活性增强。（2）BMSCs移植可以在一定程度上下调促炎细胞因子IL-6和TNF-a的表达,并上调抗炎细胞因子IL-10的表达,同时可以在一定程度上抑制核因子κB的激活。结论1.采用密度梯度离心和贴壁培养法可以获得相对均一的BMSCs。2.AMI后即刻移植BMSCs可以在受体心肌中存活,并且可以抑制梗死后心室重构,延缓心功能的恶化。3.BMSCs移植可以增加梗死区胶原蛋白沉积,同时抑制非梗死区胶原蛋白沉积,这种对胶原蛋白代谢的双重调节作用,可能是其抑制梗死后心室重构的机制之一。4.BMSCs移植一定程度上可以抑制AMI后心肌细胞毒性淋巴细胞的激活,调节心肌组织中促炎细胞因子和抗炎细胞因子的表达平衡,从而减轻AMI后的病理性免疫反应。