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端粒的生物学功能主要是保护染色体末端,避免核酸酶对染色体末端的降解,防止染色体之间发生融合和重排,在维持基因组结构的完整性和稳定上起重要作用。端粒酶由端粒酶逆转录酶（Telomerase Reverse Transcriptase, TERT）和端粒酶RNA （Telomerase RNA component , TR或TER）模板组成的具有特殊逆转录活性的核糖核蛋白复合物。它以自身RNA为模板通过逆转录合成端粒重复序列,并连接到染色体3’末端。大多数肿瘤细胞是通过端粒酶表达的上调来维持端粒长度。hTERT是控制细胞端粒酶活性的限制性成分,hTERT对维持肿瘤细胞的生长非常重要,抑制肿瘤细胞中hTERT的表达时,这些细胞便会衰老或者凋亡。hTERT蛋白保守区上单个氨基酸的改变可以使端粒酶活性改变甚至消失。hTERT蛋白胞内运输是其翻译后水平一种重要的功能调控形式。研究发现,hTERT的核内定位分布行为在正常细胞和肿瘤细胞间存在显著的差异。在正常细胞中表达的hTERT蛋白是聚集分布在细胞核的核仁结构中。在发生转化的细胞或肿瘤细胞中,hTERT则主要弥散分布在细胞核的核仁外。此外,染色体DNA损伤则能诱导肿瘤细胞中核仁外分布的hTERT聚集到核仁。这些现象提示hTERT的核仁定位调控对细胞癌变及肿瘤细胞生存有影响。但目前关于调控hTERT核仁定位的结构基础、分子机制及其在肿瘤中的生物学意义并不清楚。hTERT C端氨基酸序列在调节hTERT细胞内定位有重要作用,也是其在细胞内进行端粒末端复制所必需的结构域。我们实验室林坚博士发现hTERT C端存在着一个新的核仁定位结构域（C-NoLD）,进一步鉴定出第965-980氨基酸序列中富含的保守性碱性氨基酸残基是决定hTERT核仁定位的关键信号。该定位信号序列发生突变的hTERT突变体,不仅在正常的细胞培养条件完全丧失定位于核仁的能力,而且同时丧失了对DNA损伤诱导的核仁定位的反应能力。为了进一步揭示hTERT细胞内定位的结构基础,以及hTERT DNA损伤反应核仁定位调控的分子机制。通过结构与功能关系的研究方法,将hTERT C端不同基因片段构建到带有绿色荧光蛋白标签的真核表达载体pLEGFPC1上。比较分析hTERTC端片段细胞内分布情况,以及染色体DNA损伤情况下定位的变化。进而对端粒酶催化亚基核仁定位的分子机理及生物学意义进行阐述。我们发现C端882-953aa序列在调控hTERT胞内定位中也有重要作用。缺失了882-953aa的hTERT突变体能显著提高hTERT的核定位能力,提示了这一氨基酸序列具有负调控hTERT细胞核定位的生物学效应。但有意思的是,在肿瘤细胞中表达缺失了882-953aa的hTERT突变体同时也丧失对DNA损伤诱导核仁定位的反应性。然而与我们先前鉴定出的hTERTaa965-981的核仁定位信号不同,hTERT第882-953氨基酸序列并不存在核仁靶向信号的活性,说明其在调控hTERT核仁定位中存在新的分子机制,进一步阐明hTERTaa882-953序列在调控hTERT DNA损伤反应中核仁定位的分子机制对改善和提高肿瘤细胞放化疗治疗的反应性有重要意义。端粒酶在肿瘤细胞和正常细胞中的差异性表达使其被认为是肿瘤诊断的指标和肿瘤治疗的新靶点。近年来以端粒酶为靶点的抗肿瘤药物成为肿瘤治疗研究的热点。虽然端粒酶抑制剂具有高效、特异和广谱性,可能对晚期和扩散肿瘤也有效,但是在正常人体细胞端粒酶的表达不是完全抑制,而是受到严格的细胞周期依赖性的调控,存在一过性短暂低表达,这对维持细胞的分裂增殖能力具有重要性。完全抑制正常细胞中的端粒酶表达能迅速造成细胞丧失分裂增殖能力,提前进入细胞复制性衰老,因此针对端粒酶的肿瘤治疗策略的安全性引起人们的忧虑。我们在前期研究中发现,在hTERT阳性的HeLa细胞中过表达hTERT的C端片段C27（882-1132aa）,会造成细胞衰老和凋亡。体内实验证明稳定表达hTERTC27能抑制端粒酶阳性肿瘤在裸鼠体内的致瘤性,而且hTERTC27的表达并不影响肿瘤细胞内的端粒酶活性。但介导hTERTC27抗肿瘤活性的关键氨基酸序列尚不清楚。由于我们已发现了hTERTaa882-953序列在调控hTERT的多种胞内定位行为中具有重要作用,提示了其在hTERT介导的细胞生物学功能上的重要性。我们因此提出hTERTaa882-953序列可能是hTERTC27抗肿瘤活性的关键结构原件。本论文采用细胞核型观察及台盼蓝染色观察hTERTaa882-953对肿瘤细胞的杀伤作用。将hTERTC端片段构建到慢病毒表达载体上,观察这些片段对肿瘤细胞生长的影响。通过TRAP法检测hTERTaa882-953感染肿瘤细胞后对端粒酶活性变化的影响。结果发现在端粒酶阳性肿瘤细胞中高表达hTERTaa882-953序列对肿瘤细胞有急性杀伤作用,并明显抑制肿瘤细胞生长。而且与hTERTC27一样,高表达hTERTaa882-953序列对端粒酶活性并没有影响。此外,缺失了aa882-953序列的hTERT C端片段则丧失了杀伤肿瘤细胞的效果。因此我们证明了hTERT aa 882-953是hTERTC27抑制肿瘤细胞生长功能的主要结构域。我们的研究结果将为肿瘤治疗提供了一条新的途径。