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壳聚糖纳米颗粒具有良好的分子负载功能，因而被广泛用作基因、蛋白质以及小分子药物等生物活性物质的输运载体。由于纳米壳聚糖制备等技术原因的局限，目前药用的纳米壳聚糖载体粒径大多在100nm以上，绝少有小于50nm的应用实例。然而，考虑到纳米颗粒在生物体内的吸收与利用与其尺寸有着密切的关联，粒径越小往往越能促进生物活性分子的有效吸收。鉴于此，本论文从小粒径Trolox-壳聚糖纳米颗粒的制备入手，探索了它对叔丁基氢过氧化物(t-BHP)氧化损伤RAW264.7细胞过程的抗凋亡保护效果与作用机制。研究所得的具体实验结果如下：
1、小粒径Trolox-壳聚糖纳米颗粒的制备、表征与生物相容性研究
通过氧化降解方法可直接获得小分子量壳聚糖，随后加入环氧乙烷进行羟乙基化修饰，自组装形成水溶性的纳米颗粒。经透射电镜和原子力显微镜对该纳米颗粒进行形态表征，显示粒径分布均匀，约为30nm;对RAW264.7细胞活力影响的MTT实验结果进一步显示，所制备的壳聚糖自组装纳米颗粒具有无毒、生物相容性好的特点。此外，尽管抗氧化剂Trolox自称水溶性维生素E，但其水中溶解度仍然十分有限，这直接影响到它的生物利用度。本研究将Trolox自组装在水溶性壳聚糖颗粒之内部，所获得的Trolox-壳聚糖纳米颗粒在水溶液中的溶解度较Trolox单体提高27倍之多，也体现出该纳米颗粒对小分子物质的高负载效率。
2、t-BHP氧化损伤RAW264.7细胞实验模型的建立
为验证Trolox-壳聚糖纳米颗粒的抗氧化活性，首先建立了t-BHP氧化损伤RAW264.7细胞的实验模型。
t-BHP可诱导RAW264.7细胞产生“凋亡小体”；DNA ladder分析以及流式细胞仪Annexin-Ⅴ/PI双染色法的检测结果都显示，t-BHP的浓度与RAW264.7细胞凋亡程度呈线性依赖关系；当采用Western blotting方法进一步检测线粒体凋亡通路上三个决定性的蛋白分子(Bax、Bcl-2与pro-caspase3)的表达情况，发现t-BHP诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡过程中，启动了线粒体介导的细胞凋亡通路。
3、Trolox-壳聚糖自组装纳米颗粒抑制t-BHP氧化损伤RAW264.7细胞的抗凋亡保护效果
(1)对氧化损伤与细胞凋亡的抑制效果：MTT结合MDA实验结果显示：Trolox壳聚糖纳米颗粒与Trolox单体相比，前者显著抑制t-BHP对RAW264.7细胞造成的氧化损伤，直至细胞活力与丙二醛含量恢复到对照组正常水平；细胞形态学观察结果进一步支持上述结论；关于细胞凋亡的流式细胞术检测结果发现，300μM t-BHP作用于RAW264.7细胞1h后可显著诱导细胞凋亡，而预先添加等浓度Trolox-壳聚糖纳米颗粒与Trolox单体对细胞凋亡的同比效率显著增加，且其抑制效果与Trolox-壳聚糖纳米颗粒的浓度呈线性依赖关系。当浓度为1mM时，其保护效果可使细胞状态恢复至对照组水平。
(2)对凋亡抑制的机理研究：为阐明Trolox-壳聚糖纳米颗粒抑制t-BHP诱导RAW264.7细胞凋亡的机理，实验采用Western blotting方法检测线粒体凋亡通路上的三个凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2与pro-caspase3)的表达情况，结果表明：Trolox-壳聚糖纳米颗粒可浓度依赖地抑制促凋亡蛋白Bax的表达，而上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制pro-caspase3的活化；且当Trolox-壳聚糖纳米颗粒的浓度为1mM时，其抑制效果尤为显著。激光共聚焦成像结果进一步展示Trolox壳聚糖纳米颗粒可被RAW264.7细胞借助胞吞方式高效跨膜输运，进而通过抗氧化方式抑制线粒体介导的细胞凋亡通路。