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1、研究背景类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以对称性多关节炎为主要临床症状的慢性全身性自身免疫性疾病。其基本病理改变为滑膜炎,表现为滑膜细胞增殖、炎性细胞浸润、血管翳形成以及软骨和骨的进行性破坏。患者早期大多有关节僵硬、疼痛等症状,随病情发展累及全身,可导致全身性骨质疏松。随着RA病情发展,成骨细胞(Osteoblasts,OBs)介导的骨形成与破骨细胞(Osteoclasts,OCs)介导的骨吸收之间失调,是导致骨代谢失衡的重要因素。大量研究表明,Wnt(Wingless/Integrated)/β-catenin信号通路在骨重塑过程中发挥重要作用,一方面Wnt/β-catenin信号通路可直接调节OBs的分化和功能;另一方面其通过调节OBs中骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)的水平竞争性抑制OCs的分化和功能。βcatenin作为Wnt信号通路关键基因,研究发现,在胚胎发育早期,与骨形成相关标志物水平在缺失β-catenin基因的间充质干细胞中表达降低。LRP5为细胞膜上介导Wnt信号通路的主要受体之一,其功能增减可以影响Wnt/β-catenin信号通路对OBs的效应。研究表明,LRP5基因敲除小鼠OBs分化受抑制。在中医理论中,“肾虚”被认为是RA骨代谢异常的主要病因病机,其通过影响OBs与OCs之间的稳态,导致骨重塑异常。二至丸(Er Zhi Pill,EZP)为我国古代名方,由女贞子、墨旱莲两味中药组成,具有补益肝肾,滋阴止血等功效。现代研究表明其具有抗炎,抗衰老等作用,临床也常被用于治疗骨质疏松。研究表明,EZP可通过Wnt3a/LRP5/β-catenin信号通路抑制去卵巢大鼠下颌骨骨小梁微结构降解和牙槽骨丢失,进而对骨质疏松起到防治作用。甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)为临床治疗RA的一线用药,可抑制RA炎症和骨破坏。研究发现,MTX可以促进与OBs功能相关蛋白BALP表达。但MTX临床治疗RA具有个体差异,积极探索MTX的联合用药,特别是与中医联合应用具有重要意义。目前,尚未有研究报道MTX联合EZP是否能增加MTX对RA的治疗效果,故本实验旨在探讨MTX联合EZP是否可以增强MTX对RA的治疗效果,及其可能的作用机制。2、研究目的研究MTX联合EZP通过促进骨生成对RA治疗的增效作用,并探讨Wnt1/LRP5/β-catenin信号通路在其中机制。3、实验方法3.1网络药理学预测MTX联合EZP治疗RA的可能作用机制利用ETCM数据库和Pubchem数据库查找EZP中所含的化学成分,再通过NCBI Gene线上数据库查找EZP、MTX所对应的人源靶蛋白和人源RA相关基因;借助IPA生物网络分析平台构建EZP靶蛋白、MTX靶蛋白与RA三者之间的相互作用网络,进一步分析网络节点的功能及相关的生物学通路,最终预测出EZP与MTX共同发挥RA治疗作用的优势生物学通路。3.2动物实验验证MTX联合EZP对CIA大鼠关节骨保护的增效作用和机制利用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析 EZP中特女贞苷的含量。建立CIA大鼠模型,分别予以MTX、EZP和MTX+EZP灌胃治疗,持续治疗28天,期间每3天进行一次关节炎评分至实验结束。通过H&E染色和Micro-CT扫描评估MTX和EZP联用对CIA大鼠踝关节的病理改变和骨侵蚀影响;通过ELISA测定大鼠血清骨代谢标记物抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosplhatase,TRACP)、骨碱性磷酸酶(Bone alkalin phosphatase,BALP)蛋白表达水平;通过RT-PCR方法检测大鼠关节中与OBs成熟、功能相关基因Wnt1,LRP5,β-catenin,Runx2,BGP和BALP等mRNA表达水平;通过RT-PCR方法检测大鼠关节中与OCs分化和功能相关基因OPG、RANKL、RANK、c-Fos和NFATc1等mRNA表达水平。3.3细胞实验探究Wnt1/LRP5/β-catenin信号通路在MTX联合EZP对OBs影响的机制利用成骨细胞系UMR-106作为研究对象,采用不同处理下的大鼠含药血清干预。细胞分为对照组(Control组),CIA模型组(CIA组),CIA+MTX含药血清组(MTX组),CIA+EZP含药血清组(EZP组)和CIA+MTX+EZP含药血清组(MTX+EZP组)。各组分别加入15%的含药血清。干预培养48h后,通过CCK-8法检测各组含药血清对OBs增殖速率的影响;通过RT-PCR法检测OBs中Wnt1、LRP5、Runx2、BGP和BALP等与Wnt/β-catenin信号通路和OBs成熟、功能相关mRNA基因的表达。4、结果4.1网络药理学预测MTX联合EZP治疗RA的可能作用机制在ETCM数据库共检索到EZP的化学成分62种,其中女贞子21种,墨旱莲41种。通过PubChem数据库检索,共得到EZP靶蛋白1454个,MTX靶蛋白共102个。在Gene数据库共得到RA人类相关基因1 148个。经过IPA信号通路模块分析发现:EZP与MTX靶蛋白共同参与的信号通路有328条,RA人类相关信号通路共374条,进一步通过IPA平台对EZP与MTX靶蛋白共同参与的信号通路进行权重排列,发现EZP与MTX靶蛋白和RA基因共同参与的前14条信号通路中,Wntβ-catenin信号通路是排在首位的信号通路。此结果提示EZP与MTX可能通过Wnt/β-catenin信号通路调节OBs的增殖、分化和成熟,从而发挥对RA的骨保护作用。4.2 MTX联合EZP对CIA大鼠关节骨保护的协同作用和机制利用HPLC法分析后确定,本次实验中使用EZP质量符合《中国药典》要求,可用于后续实验。各组大鼠干预28天后,与正常组对比,CIA组大鼠踝关节及以下部位发生严重肿胀和退变,双后肢关节评分和踝关节病理评分显著上升(P<0.01);与CIA组对比,MTX组、EZP组和MTX+EZP组大鼠踝关节及以下部位肿胀程度出现不同程度好转,MTX组和MTX+EZP组双后肢关节评分和踝关节病理评分显示出统计学差异(P<0.05,P<0.01);与MTX组对比,MTX+EZP组关节评分与踝关节病理评分显著降低(P<0.01或P<0.05)。Micro-CT结果显示:与Control组对比,CIA组踝关节BS值、BS/BV值明显升高(P<0.05),BV值显著降低(P<0.05);与CIA组对比,对于BS值,仅MTX+EZP组降低(P<0.05),对于BV值,MTX组、EZP组和MTX+EZP组均明显提高(P<0.05),对于BS/BV值,仅MTX组与MTX+EZP组显著降低(P<0.05,P<0.01);与MTX组对比,MTX+EZP组BS/BV值明显改善(P<0.05)。ELISA结果显示:与Control组对比,CIA组大鼠血清中BALP水平显著降低(P<0.05),TRACP水平上调(P<0.05);与CIA组对比,MTX、EZP和MTX+EZP各组大鼠血清中BALP水平均有不同程度升高(P<0.05 或 P<0.01),TRACP 水平下降(P<0.05);与 MTX 组对比,MTX+EZP 组BALP水平升高程度显著(P<0.05)。关节部位OBs相关基因表达结果如下:与Control组对比,CIA 组大鼠关节中 Wnt1、LRP5、β-catenin、Runx2、BALP 和 BGP 的 mRNA表达显著下调(P<0.05或P<0.01):与CIA组对比,MTX、EZP和MTX+EZP各组Wnt1、LRP5、β-catenin、BALP 和 BGP 基因表达明显上升,其中除 EZP 组 Runx2 mRNA无差异外,其余各组与CIA组对比皆有统计学差异(P<0.05或P<0.01);与MTX组对比,MTX+EZP组以上六个基因表达水平均显著上调(P<0.05)。此外,针对关节与OC分化相关通路的基因表达检测显示:与Control组对比,CIA组OPG基因水平显著降低(P<0.01);RANKL、RANK、c-Fos 和 NFATcl mRNA 的表达升高(P<0.05);与 CIA组对比,MTX组和MTX+EZP组OPG基因表达明显上升(P<0.05),且RANKL、RANK、c-Fos 和 NFATcl mRNA 显著下降(P<0.01 或P<0.05)。4.3 MTX联合EZP通过Wnt1/LRP5/β-catenin信号通路对OBs分化和功能的影响对体外培养OBs给予含药血清干预48h。经CCK-8检测后,与Control组对比,CIA组OBs增殖率明显降低(P<0.05);与CIA组对比,MTX和MTX+EZP组OBs增殖率提高(P<0.05),但MTX组与MTX+EZP组之间无明显统计学差异;RT-PCR法检测OBs中相关基因显示,与Control组对比,CIA组Wnt1、LRP5、Runx2和BGP基因表达降低(P<0.05);与 CIA 组对比,MTX 组、EZP 组和 MTX+EZP 组的 Wnt1、LRP5 和 BALP mRNA的表达显著上调(P<0.01或P<0.05),MTX+EZP组Runx2、BGP mRNA表达水平显著增加(P<0.01,或P<0.05),而MTX组和EZP组中Runx2、BGP mRNA表达与CIA组对比无统计学差异;与MTX组对比,MTX+EZP组Wnt1、LRP5基因表达水平显著上调(P<0.05);5、结论MTX联合EZP治疗RA可通过Wnt1/LRP5/β-catenin信号通路发挥促进骨形成的协同作用。