SNHG1/miR-154-5p/miR-376b-3p/FOXP2/KDM5B反馈环路调节胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子机制研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yohoban
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目的:脑胶质瘤是成人最常见的原发性脑肿瘤,尽管手术、放疗、化疗等治疗方式在不断改善,胶质瘤患者的预后依旧很差。研究表明编码基因仅占基因组序列长度的2%以下,编码基因尚不足以阐明胶质瘤形成及恶变的分子机制,占基因组序列绝大多数的非编码RNA的失调也会影响肿瘤的发生发展。长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs,lncRNAs)和miRNAs均为经典的非编码RNA。LncRNAs是一类无蛋白编码能力的RNA,它与其他分子的相互作用在多个调控水平产生了复杂的基因调节功能。在胶质瘤研究中,lncRNA小核仁RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1,SNHG1)可作为多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)疾病诊断和预后的风险因子。有学者研究发现下调SNHG1的表达可降低胶质瘤细胞增殖和侵袭能力,增加细胞凋亡,胶质瘤组织中SNHG1的上调表达与不良预后正相关,但是并未对SNHG1产生生物学效应潜在的分子机制进行深入的研究。短链非编码RNA中最具代表性的为miRNAs,miRNAs可以通过与靶信使RNA(mRNA)的3’UTR完全或不完全互补配对结合,导致靶基因降解或抑制其蛋白质翻译,参与基因的表达调控,在发育、细胞增殖、凋亡、分化等基本的细胞生物学过程中起重要作用。生物信息学软件预测发现了两个miRNAs与SNHG1相关联。其一为miR-154-5p,近期研究表明其可作为抑癌因子,通过结合抑制PIWIL1调节胶质母细胞的增殖和转移行为并预测胶质瘤患者预后。其二为miR-376b-3p,研究表明miR-376b-3p参与了肝癌等其他组织恶性肿瘤的发生过程,然而在人类胶质瘤中,miR-376b-3p的功能尚不十分清楚.我们实验小组发现上述两个miRNAs在胶质瘤组织中低表达。通过生物信息学软件分析发现上述miRNAs作用的共同靶向基因为叉头框蛋白P2(FOXP2)基因,FOXP2属于叉头框转录因子家族,其表达于多种组织中,尤其在脑发育和成熟过程中起重要作用。FOXP2与胶质瘤的关系尚未见报道。FOXP2作为转录因子可作用于组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶5B(lysine(K)-specific demethylase 5B,KDM5B)启动子区域,现有很多研究已经证实KDM5B作为促癌因子参与多种组织的肿瘤发生过程。在神经系统疾病中,KDM5B的过表达能增强神经细胞瘤的致瘤性及药物抵抗。本研究为明确SNHG1、miR-154-5p、miR-376b-3p、FOXP2与KDM5B在胶质瘤中的内源性表达,以及对胶质瘤细胞生物学行为的作用,进一步探讨SNHG1是否能够通过调节miR-154-5p和miR-376b-3p的表达,进而调控FOXP2及KDM5B的表达,影响胶质瘤细胞的生物学行为及其机制,旨在为人脑胶质瘤的靶向精准治疗提供依据。研究方法:1.U87及U25细胞的培养。2.Real-time PCR方法分别检测SNHG1、miR-154-5p、miR-376b-3p和FOXP2及KDM5B的内源性表达。3.构建SNHG1沉默质粒及miR-154-5p、miR-376b-3p和FOXP2的过表达和沉默的质粒。4.双荧光素酶报告基因验证结合位点。5.RNA免疫共沉淀实验验证SNHG1与miR-154-5p、miR-376b-3p的特异性结合。6.CCK-8实验检测细胞增殖能力。7.Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力。8.流式细胞仪检测细胞凋亡率。9.Western Blot方法检测FOXP2、KDM5B和PI3K/Akt通路相关蛋白的表达变化。10.荧光素酶实验验证FOXP2调控KDM5B启动子区活性。11.染色质免疫共沉淀验证FOXP2与KDM5B启动子区的特异性结合。12.RNA免疫共沉淀及pull-down实验验证KDM5B与SNHG1的特异性结合。13.裸鼠移植瘤模型检测肿瘤生长及裸鼠生存期的变化。结果:1.TCGA数据库分析与正常脑组织相比,SNHG1在胶质瘤样本中表达显著升高(P<0.01)。通过qRT-PCR检测SNHG1在胶质瘤组织和细胞中高表达(P<0.01),随病理级别的升高表达增加,沉默SNHG1的表达抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.01)。2.TCGA数据库分析与正常脑组织相比,miR-154-5p与miR-376b-3p的表达显著减低(P<0.01)。通过qRT-PCR检测miR-154-5p和miR-376b-3p在胶质瘤组织和恶性胶质瘤细胞中低表达,随病理级别的升高表达降低(P<0.01),过表达miR-154-5p或miR-376b-3p抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.01)。3.TCGA数据库通过Pearson相关性分析验证miR-154-5p和miR-376b-3p表达量分别与SNHG1呈显著反向相关(P<0.01)。沉默SNHG1的表达增加了miR-154-5p和miR-376b-3p的表达(P<0.01),RNA免疫共沉淀实验证实SNHG1与miR-154-5p、SNHG1与miR-376b-3p之间存在靶向结合发挥miRNAs海绵作用。4.双荧光素酶报告基因实验验证miR-154-5p或miR-376b-3p可通过与FOXP2mRNA的3’UTR区域直接结合而降低FOXP2的表达水平(P<0.01),从而抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.01)。5.Western Blot方法检测FOXP2在胶质瘤组织和细胞中高表达,随病理级别的升高表达增加(P<0.01)。沉默转录因子FOXP2的表达可降低其下游KDM5B的转录表达(P<0.01),抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.01)。6.Western Blot方法检测KDM5B在胶质瘤组织和细胞中高表达,随病理级别的升高表达增加(P<0.01)。沉默恶性胶质瘤细胞中KDM5B的表达通过抑制PI3K/Akt信号通路,抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.01)。7.通过qRT-PCR检测发现沉默KDM5B也能够降低SNHG1的表达水平(P<0.01),RNA免疫共沉淀及pull-down实验验证KDM5B与SNHG1的特异性结合形成正反馈调节环路,其机制为KDM5B发挥RNA结合蛋白的作用与lncRNA SNHG1之间结合并维持其稳定性。8.沉默SNHG1的同时过表达miR-154-5p、miR-376b-3p能够显著抑制胶质瘤的生长,延长裸鼠生存时间。结论:1.SNHG1作为促癌基因可促进胶质瘤细胞恶性生物学行为。2.miR-154-5p和miR-376b-3p可抑制胶质瘤细胞恶性生物学行为。3.SNHG1结合下调miR-154-5p与miR-376b-3p的表达发挥调控作用。4.FOXP2作为促癌基因可促进胶质瘤细胞恶性生物学行为,miR-154-5p和miR-376b-3p可作用于FOXP2发挥生物学效应。5.KDM5B作为促癌基因可促进胶质瘤细胞恶性生物学行为,FOXP2可直接作用于KDM5B启动子区增强其表达。6.SNHG1通过抑制miR-154-5p和miR-376b-3p调节FOXP2的表达水平,进一步调控KDM5B的表达水平,KDM5B可结合SNHG1维持其稳定性形成正反馈环路。
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