【摘 要】
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奶牛子宫内膜炎是奶牛产后常见的生殖系统疾病。是奶牛由于生产,营养,病原菌感染等因素引起子宫内膜层细胞出现炎症反应。是造成奶牛不孕症的主要原因之一,给奶牛养殖业带来巨大的损伤。但有关奶牛子宫内膜炎的具体分子病理作用机制仍不十分清楚且并未有治疗该病的特效药出现。近年来研究表明:细胞在炎症反应中的程序性死亡方式有别于细胞其他程序性死亡方式,这可能成为奶牛子宫内膜炎的一种分子病理机制。而丹参则是被应用于治
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奶牛子宫内膜炎是奶牛产后常见的生殖系统疾病。是奶牛由于生产,营养,病原菌感染等因素引起子宫内膜层细胞出现炎症反应。是造成奶牛不孕症的主要原因之一,给奶牛养殖业带来巨大的损伤。但有关奶牛子宫内膜炎的具体分子病理作用机制仍不十分清楚且并未有治疗该病的特效药出现。近年来研究表明:细胞在炎症反应中的程序性死亡方式有别于细胞其他程序性死亡方式,这可能成为奶牛子宫内膜炎的一种分子病理机制。而丹参则是被应用于治疗产科疾病的主要中药之一,其主要药理成分具有较强的抗菌消炎作用,故选用其主要水溶性成分丹酚酸B来治疗子宫内膜炎并探寻其作用机制。首先采用不同浓度的LPS来感染奶牛子宫内膜上皮细胞（BEEC）,构建子宫内膜上皮细胞炎症模型来模拟子宫内膜炎病理过程,以此来研究子宫内膜炎过程中是否出现细胞焦亡及其机制。我们采用0、3、10、30ug/m L LPS分别感染BEEC 24h,通过检测（1）相关炎症因子IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-α分泌和m RNA表达,（2）细胞外LDH活性,（3）以扫描电子显微镜下细胞膜形态变化来确定细胞炎症模型构建成功和细胞膜破裂。随后通过对经典和非经典炎症小体通路相关因子（NLRP3、ASC、CASPASE-1、CASPASE-4）和细胞焦亡关键执行蛋白GSDMD m RNA和蛋白表达及切割的检测来确定细胞焦亡的出现及其机制。结果表明:LPS可以通过经典和非经典炎症小体通路来诱导BEEC焦亡,这可能是奶牛子宫内膜炎过程中的关键机制。然后,我们使用不同浓度的丹酚酸B作用于BEEC,采用CCK-8检测试剂盒来确定其最佳作用浓度和时间。在此基础上选择低（50u M）、中（100u M）和高（150u M）三个丹酚酸B剂量组来治疗LPS（30ug/m L）诱导的BEEC炎症模型,选择治疗时间6h、12h和24h三个时间点,检测（1）相关炎症因子IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-α分泌和m RNA表达,（2）细胞外LDH活性,（3）以扫描电子显微镜下细胞膜形态变化来说明丹酚酸B对BEEC炎症的治疗作用。进一步检测TLR4通路和炎症小体通路相关因子m RNA和蛋白表达来研究丹酚酸B的作用机制。结果表明:丹酚酸B作用24h后,可以缓解LPS导致的细胞炎症且其机制与TLR4通路和经典炎症小体通路相关。同时,我们用雌性SD大鼠进行体内造模和给药研究。采用子宫注射2mg/m L LPS 200u L 24h的方法构建大鼠子宫内膜炎模型,通过查阅相关文献确定丹酚酸B的治疗剂量为:低（10mg/kg）、中（20mg/kg）、高（40mg/kg）,选用地塞米松磷酸钠注射液作为阳性药物对照组,其给药剂量等同于丹酚酸B中剂量,治疗给药方式为腹腔注射,治疗时间为48h,每隔12h给药一次,共给药三次,最后一次给药12h后麻醉并处死大鼠,取大鼠子宫,观察其形态变化,剪取部分子宫进行石蜡切片和HE染色,观察子宫组织病理学变化。其余部分子宫分别提取RNA和蛋白,检测相关炎症因子和信号通路关键因子表达。结果表明:LPS子宫灌注可以导致大鼠子宫内膜炎的发生,而丹酚酸B,可通过TLR4和经典炎症小体通路缓解炎症。其次,为了进一步探究丹酚酸B治疗奶牛子宫内膜炎可能的分子作用机制,我们进行了细胞的蛋白组学研究,选取丹酚酸B作用效果最好的时间点24h为研究时间,通过华大基因进行DIA蛋白质组学研究并进行差异蛋白后续分析,通过聚类分析,GO富集分析和KEGG富集分析,我们最终选取了氧化磷酸化通路上的两个关键因子NDUFB7和UQCR11进行基因表达验证。结果表明:能量代谢尤其是线粒体上的呼吸链氧化磷酸化过程也是奶牛子宫内膜炎验证过程中重要的通路且丹酚酸B可以通过降低该过程中关键因子基因表达来缓解炎症。
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