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鹿茸是雄性梅花鹿额骨顶部能够每年周期性脱落与再生的骨质器官,也是哺乳动物中唯一脱落后可完全再生的附属器官。其以惊人的速度每年完全再生一次而不发生任何癌变,这在哺乳动物中是绝无仅有的。因此,鹿茸也就成为了一种研究器官再生及癌症治疗的理想医学模型。鹿茸的周期性发育受到多种因素的调控,包括生长因子、激素、光照和温度等。MicroRNA(mi RNA)是真核生物基因组非编码区转录加工生成的内源性小分子单链非编码RNA,具有局部发夹结构,广泛存在于包括单细胞藻类在内的所有真核生物中,其结构在生物进化过程中表现出了高度的保守性。miRNA与mRNA的3,UTR结合后能够在不影响靶基因mRNA转录的前提下抑制其翻译。超过半数以上的哺乳动物蛋白质非编码区基因受到miRNA的调控。有研究表明,miRNA能够通过调控鹿茸细胞中相关生长因子的表达进而调控鹿茸细胞的增殖。Ⅱ型转化生长因子受体(TGF-βRⅡ)是TGF-β通路中的一种高亲和力受体,其负责接收并传递信号,是一种磷酸化蛋白。mi RNA-17-92基因簇是脊椎动物中一类保守的基因簇,其包含mi RNA-17-3p、mi RNA-17-5p、mi RNA-18a、miRNA-19a、miRNA-19b、miRNA-20a、miRNA-92a等7个成员。有研究表明,miRNA-17-92基因簇对TGF-β通路的信号传递会产生显著影响。但是,目前国内外关于梅花鹿miRNA-17-92基因簇对TGF-βRⅡ的转录调控作用的研究尚未见报道。本研究采集分离梅花鹿鹿茸软骨组织并进行体外细胞培养及软骨细胞的鉴定,利用TargetScan和miRanda两种生物信息学软件联合分析TGF-βRⅡ的3’端非编码区部分序列(3’UTR),预测能够与其相互作用的miRNA。根据课题组前期制备的梅花鹿鹿茸miRNA芯片对miRNA-17-92基因簇成员进行分析,筛选出在鹿茸顶端软骨及间充质两种组织中差异表达显著的mi RNA。合成TGF-βRⅡ的3’端非编码区序列(3’UTR),并构建TGF-βRⅡ基因3’UTR野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体并进行荧光素酶活性检测以验证miRNA靶基因。再将人工合成的miRNA模拟物转染鹿茸软骨细胞,MTT法检测转染miRNA模拟物后软骨细胞体外增殖速率的变化;Western blot分析梅花鹿TGF-βRⅡ蛋白的相对表达水平及miRNA对IGF-1、TGF-β2等其它细胞生长因子表达的影响。鹿茸软骨细胞鉴定结果表明:成功反转录了梅花鹿软骨特异性基因ColX部分序列,序列长度为1771bp,与GeneBank中报道的梅花鹿ColX基因序列相似性为99%,结合对软骨细胞形态的观察比较,软骨细胞鉴定成功,分离的细胞可以用于后续实验。软件分析结果表明:miRNA-19a和miRNA-19b在TGF-βRⅡ的3’UTR上存在结合位点,鹿茸miRNA芯片分析结果表明:miRNA-19a和miRNA-19b在鹿茸顶端不同组织中存在差异表达,说明mi RNA-19a和miRNA-19b可能会对该mRNA的表达发挥一定影响。为了进一步探讨miRNA-19a和mi RNA-19b对梅花鹿鹿茸TGF-βRⅡ的转录调控作用及其与鹿茸细胞生长的关系,成功构建了含有miRNA-19a和miRNA-19b结合位点的TGF-βRⅡ基因3’UTR野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体。荧光素酶活性检测结果显示:与阴性对照组相比,转染了野生型质粒和两种miRNA的细胞荧光素酶活性明显降低,而转染突变型质粒和两种miRNA的细胞组荧光素酶活性无明显变化。这一结果证明:TGF-βRⅡ是受miRNA-19a和miRNA-19b调控的靶基因,与前期预测结果一致。MTT法和western bloting结果显示,鹿茸软骨细胞的体外增殖受到抑制,TGF-βRⅡ蛋白及IGF-1和TGF-β2等其它细胞生长因子的相对表达水平下降,且呈时间依赖性。