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视神经疾病是以视网膜节细胞(retinal ganglion cell,RGC)渐进性死亡为主要特点的疾病,RGC一但死亡或损伤后不能有效再生,保护RGC、预防视神经损伤一直为眼科研究领域关注的重点。非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)是神经元受到损伤刺激后首先做出的反应,起到保护神经元或诱导神经元凋亡的作用。近来研究提示,UPR可能与视网膜神经细胞及其纤维渐进性死亡密切相关。本实验观察大鼠视神经夹伤后其RGC中的UPR,初步探讨UPR在视神经损伤中的作用与反应机制。目的:1.通过夹伤大鼠视神经,并行视觉电生理检查,建立可靠的实验模型。2.研究大鼠视神经夹伤后RGC的非折叠蛋白相关因子(PERK,IRE-1,calnexin)、AMPA受体亚基GluR2及凋亡细胞的表达,并分析其相互关系。方法:实验一:建立大鼠视神经夹伤模型并行视觉电生理检查1.建立大鼠视神经夹伤模型暴露成年雄性SD大鼠视神经,反向镊以垂直角度于球后2mm处钳夹视神经20s。2.视觉电生理检查分别检测大鼠正常及视神经夹伤后4 h,8 h,12 h,1d,3d,7d损伤眼F-VEP、ERG的峰潜时和波幅变化。实验二:大鼠视神经夹伤后视网膜节细胞的非折叠蛋白反应1.按随机数字方法将动物分为对照组(4只)、损伤组(夹伤后不同时间组即4h,8h,12h,1d,3d,7d,共6组,每组4只)。对照组不夹伤视神经。各损伤组大鼠按上述时间点制备视网膜切片以备如下检查。2.免疫荧光组织化学检查切片经兔抗大鼠PERK、calnexin、IRE-1+AMPA抗体染色,激光扫描共聚焦显微镜观察并采图。3.神经节细胞计数每张切片取4～5个视野,在40倍视野下对视网膜中PERK或calnexin表达阳性的神经节细胞计数。结果:1.建立大鼠视神经夹伤模型后,当时术眼瞳孔散大,光反射明显减弱,眼底血管灌注正常。术后未见伤口感染及眼底缺血表现。2.正常大鼠F-VEP峰潜时为70.19±2.14ms、波幅为22.72±1.97μV,视神经损伤后各时间点P100波峰潜时均较正常大鼠缩短,至12 h时最短,对比正常差异显著,而后逐渐延长,7 d时已长于正常水平;波幅在损伤后明显下降,各时间点均低于正常水平,4h、1d、3d、7d具有极显著差异。伤后峰潜时在最大反应b波8h、12h和1d,明适应ERG的b波各时间点,闪烁反应3d,相比正常明显延长,差异具有显著性。伤后波幅在最大反应b波4h、8h、12h明显降低,具有极显著性差异,振荡电位O2波在1d及7d时升高,具有显著性差异,明适应视网膜电图在3d时下降,具有显著性差异。3.大鼠视神经夹伤后,激光扫描共聚焦显微镜观察RGC中PERK,calnexin表达明显增强。损伤后4h,表达阳性的RGC细胞数增加,至24h时达到峰值,与对照组比较具有显著性差异(PERK,15.00±0.36对2.00±0.64;calnexin,11.75±1.44对4.00±0.57, P<0.05)。损伤后8h,RGC的IRE-1及GluR2表达增强,其中GluR2在胞膜上表达明显增强;Fluoro-Jade C染色在72h时RGC出现表达,并与GluR2共同表达。结论:1.大鼠视神经夹伤模型设计简单,便于操作,可确切的造成视神经损伤。2.大鼠视神经夹伤后的F-VEP波幅显著下降,而ERG各成分总体变化不大,说明达到建模目的。3.在视神经夹伤后,与UPR相关的PERK、IRE-1因子及分子伴侣calnexin在RGC表达增强,伤后72h时RGC出现凋亡,提示UPR参与了RGC损伤后至24h的保护过程,其后则更易诱导RGC发生凋亡。这些发现文献中未见报告。