defb48、fam12b基因在NCBI unigene数据库中属于小鼠附睾基因,其中fam12b基因在人类中有同源基因。运用蛋白序列分析软件预测出Defb48具有β-defensin结构域,Fam12b属于RNase A超家族。已有的相关研究表明这两个基因在小鼠附睾中可以检测到转录本,并且用这两个附睾基因的重组真核表达载体转染COS-7细胞证实这两个基因编码的蛋白可以被分泌到细胞外,Defb48、Fam12b蛋白可能在精子成熟过程中发挥作用,目前还未见相关的研究报道这两个蛋白发挥功能的机制。为了阐明小鼠附睾分泌蛋白Defb48、Fam12b在精子成熟中的功能,本论文开展了如下研究:1.分别克隆了小鼠附睾基因defb48、fam12b,构建原核表达载体pET28(a)-defb48、pET28(a)-fam12b,并于大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,亲和纯化获得高纯度融合蛋白。2.分别以这两个纯化的融合蛋白作为抗原免疫十周龄雄鼠后,与生育期的正常雌鼠交配,观察对后代小鼠数目以及雄鼠的精子运动活力的影响。结果表明免疫Defb48融合蛋白实验组的雄鼠所生的后代小鼠数目与对照组有显著差异,且雄鼠精子的运动活力也下降;免疫Fam12b融合蛋白实验组的雄鼠所生的后代小鼠数目与对照组无显著差异。3.运用western-blot以及免疫荧光技术观察正常生育期的小鼠精子是否会与Defb48蛋白结合而发挥作用。由于一抗用的是免疫融合蛋白后的雄鼠血清,成分较为复杂,未能检测出Defb48蛋白与精子的结合情况;但western-blot检测正常雄鼠附睾液中总蛋白时出现比预测分子量大10kD左右的特异的蛋白条带,用蛋白分析软件预测Defb48蛋白可能发生了糖基化修饰。4.为了检验用原核表达蛋白Defb48免疫雄鼠后产生的抗血清的有效性,构建了真核表达载体pcDNA3.1-defb48,转染293T细胞做过表达,转染后细胞死亡率较高,未能检测出抗血清的蛋白空间构象识别能力。本研究初步探索了小鼠附睾特异性表达的蛋白Defb48和Fam12b在精子成熟中的功能,结果显示Defb48蛋白可能对精子成熟的作用较大。这为筛选对精子成熟起重要作用的蛋白,从而制备有效的鼠疫疫苗工作奠定了基础。