猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhoea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)均属于囊膜病毒,它们在入侵猪肠上皮细胞过程中,都需要将病毒囊膜与细胞膜进行膜融合。膜融合抑制剂可以抑制囊膜的膜融合作用,是抗病毒药物研发的新方向。倒锥形脂类膜融合抑制剂通过改变病毒囊膜物理特性发挥抗病毒作用,对多种病毒同时有效。本研究发现表面活性素分子符合倒锥型膜融合抑制剂的结构特点,因而开展了对表面活性素抗病毒感染机制的研究。首先,证实了表面活性素在病毒感染细胞前发挥作用,以不破坏病毒囊膜完整性的方式插入囊膜脂分子层,降低囊膜外层脂的负向弯曲倾向性,从而抑制病毒囊膜与细胞膜融合。其次,以小鼠作为试验动物进行口服表面活性素安全性评价后,以新生仔猪作为研究对象,证实了口服表面活性素可以有效防止PEDV引起的腹泻症状。最后,通过化学合成的方法,获得了十种与表面活性素拥有相似化学组成、分子结构的合成脂肽,并发现它们均具有不同程度的抗病毒作用,其中一种合成脂肽具有更低的细胞毒性。本研究分为以下三个部分:1、表面活性素抑制PEDV和TGEV通过膜融合入侵上皮细胞的机制研究首先应用双重超滤法从枯草芽孢杆菌发酵液中提取了表面活性素,并发现其在较低的浓度范围内(15-20μg/ml)能够抑制PEDV和TGEV在上皮细胞中的复制。然后通过检测表面活性素对病毒感染细胞不同阶段的抗病毒作用,发现其直接作用于病毒粒子。孵育温度试验以及囊膜脂回收试验表明,表面活性素结合病毒囊膜具有严格的温度依赖性,提示其作用于病毒囊膜脂成分。为了进一步验证表面活性素插入囊膜脂分子层,我们合成了荧光表面活性素类似物,通过光谱学试验证实其插入病毒囊膜脂分子层特性。另外,蔗糖密度梯度离心试验结果显示,在本研究浓度范围内,表面活性素不会破坏囊膜的完整性,并以电子显微镜观察结果加以佐证。随后的膜融合抑制试验结果表明,表面活性素处理的病毒粒子与细胞膜融合的能力显著降低。同时,热力学试验表明,掺入少量表面活性素不利于人工脂膜负向弯曲的形成,证实了表面活性素膜融合抑制剂作用。结果表明:表面活性素能够插入病毒囊膜,抑制囊膜病毒入侵宿主细胞时的膜融合过程,发挥有效的抗病毒作用。2、表面活性素的口服安全评价及防治仔猪PEDV感染的研究为了研究表面活性素在体内的抗病毒作用,首先以小鼠为试验动物,进行为期28天的口服表面活性素试验,用以确定口服安全剂量。试验过程中,三个剂量组的小鼠均未出现死亡。检测结果显示,最高剂量组小鼠体重增长速率显著下降,肝损伤指标显著上升,空肠组织学检测发现有一定程度的肠绒毛损伤。其余指标各组小鼠均正常。小鼠的空肠内容物非蛋白组分的抗PEDV活性随口服表面活性素剂量逐步上升,中、高剂量组达到显著水平。这表明,表面活性素以每日20mg每千克体重剂量口服给药,可以显著提高消化道内容物的抗PEDV作用。进一步研究发现,对新生仔猪PEDV攻毒前一日起,进行每日20 mg每千克体重表面活性素口服给药,可以有效防止由PEDV感染引起的腹泻。3、合成表面活性素类似物抗PEDV活性的研究为了进一步提高表面活性素的安全性,根据其化学结构,设计并合成了 10种表面活性素类似物,分别命名为SLP 1-SLP 10。然后对它们的抗PEDV活性、溶血活性,以及关键理化指标“最低成胶束浓度”(critical micelle concentration,CMC)。表面活性素及10种表面活性素类似物之间,在抗PEDV活性指标(half effective concentration,EC50)、溶血活性指标(half cytotoxicity concentration,CC50)和 CMC方面均具有差异性,但指标之间未发现明显相关性。为开发更安全的抗病毒药物,本研究以高抗PEDV活性及低溶血活性作为筛选条件。结果表明SLP5具有最优秀的选择指数(SI=CC50/EC50)。与表面活性素相比,SLP5在保持了抗病毒活性的前提下溶血活性显著降低,选择指数由4提升至52,安全有效浓度范围扩大了 13倍。另外,SLP5与表面活性素的抗病毒机制具有一致性,对PEDV具有直接作用的抗病毒效果。本研究发现表面活性素具有膜融合抑制剂型抗病毒作用机制,并对其口服防治仔猪PEDV感染,以及化学结构优化进行了初步探索,为开发表面活性素家族肠道囊膜病毒病药物提供了的研究方向和理论基础。