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背景:急性脑梗死是神经系统常见的疾病之一,具有较高的致残率和致死率。脑缺血后会发生一系列级联化学反应,导致缺血性脑损伤加重。其中,炎症反应在脑缺血及再灌注损伤中发挥着重要作用。中枢和外周的免疫细胞均参与脑缺血后炎症反应。中性粒细胞是人外周血含量最多的免疫细胞,约占正常人外周血白细胞的50%-70%。中性粒细胞通常在各种损伤的早期即参与炎症反应,在急性脑梗死后其数量迅速增加,并向脑组织浸润。在过去,中性粒细胞被认为是一群主要发挥吞噬作用的同质性细胞,近年来越来越多的研究表明中性粒细胞至少包含两个功能对立的亚群。迄今为止,由于研究者们对于中性粒分群标志物尚未形成统一意见,中性粒细胞尚无完善和统一的分类系统。以往关于中性粒细胞在急性脑梗死中作用的研究大多认为中性粒细胞起到的作用是负面的。但中性粒细胞异质性的发现对以往的认识有很大的冲击。功能相互对立的两群中性粒细胞在脑梗死中发挥的作用是完全相反的。各亚群中性粒细胞在脑梗死后的变化和其在脑缺血损伤中的作用尚不明确。因此,本文旨在探讨急性脑梗死后外周血各亚群中性粒细胞的变化,并探究了本课题组长期研究的一项脑梗死临床治疗方法,即远隔缺血适应对中性粒细胞亚群的影响。目的:分析脑缺血及再灌注后外周中性粒细胞亚群和信号通路的表达变化;分析远隔缺血适应对中性粒细胞亚群及临床转归的影响。方法:1、使用大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）的方法构建小鼠脑缺血及再灌注模型。远隔缺血预适应组小鼠在构建缺血再灌注24h模型前,进行为期7天的双后肢缺血预处理（双后肢完全缺血5min后缓解5min,重复3个循环,每天1次）。2、用单细胞转录组学测序的方法分析小鼠脑缺血45min及再灌注24h和72h外周血中性粒细胞亚群和信号通路表达变化。3、用流式细胞术检测脑缺血45min和再灌注24h与72h及缺血预适应组小鼠外周血和脾脏各亚群中性粒细胞比例的变化,用转角实验检测小鼠脑梗死后神经功能损伤。4、招募38例发病72h以内的急性脑梗死患者,其中常规治疗组24例,远隔缺血后适应组14例。常规治疗组患者给予阿司匹林、氯吡格雷和阿托伐他汀等药物及对症支持治疗。远隔缺血后适应组患者在常规治疗的基础上,使用缺血预适应仪进行为期7天的双上肢缺血后适应（双上肢完全缺血5min后缓解5min,重复5个循环,每天2次）。另招募15名年龄、性别与常规治疗组患者相匹配的无脑梗死及其他炎症相关病史的志愿者作为对照组。5、评估患者入院及出院时NIHSS,以评价患者神经功能损伤。评估患者入院时及出院三个月时m RS,以评价患者生活能力。6、用流式细胞术检测各组患者或志愿者外周血各亚群中性粒细胞的比例。结果:1、对各组外周血白细胞整体的单细胞测序及聚类分析结果显示,小鼠外周血白细胞可分为21个亚群,其中5群属于中性粒细胞,包括:C4、C6、C14、C16、C18。与其它亚群相比,C6亚群表达较低IL1b、IL15、IL16和TNFα等促炎因子（P＜0.05）和CCL6、CCR1、CCRL2、CXCL2、CXCR2、CXCR4等趋化因子（P＜0.05）,而表达较高的抗炎因子TGFβ（P＜0.05）。进一步的表面标志物分析显示,C6亚群中性粒细胞绝大部分为CD53-细胞,而另外四群中性粒细胞绝大部分为CD53+细胞。2、与假手术组比,MCAO小鼠外周血CD53+中性粒细胞比例在脑缺血45min时略微下降（P＜0.01）,在再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）12h和24h时明显上升（P＜0.001）,在I/R72h时无明显变化（P＞0.05）。与I/R24h组相比,缺血预适应组小鼠转角实验评分明显降低（P＜0.05）。缺血预适应组小鼠外周血CD53+中性粒细胞明显低于I/R24h组（P＜0.01）,而与假手术组无明显差异（P＞0.05）。CD53-中性粒细胞变化趋势与CD53+中性粒细胞相反。3、与假手术组比,MCAO小鼠脾脏CD53+中性粒细胞比例在脑缺血45min时无明显变化（P＞0.05）,在I/R12h时有下降的趋势（P=0.061）,在IR24h和72h时明显下降（P＜0.001）。缺血预适应组小鼠脾脏CD53+中性粒细胞明显高于I/R24h组（P＜0.001）,但低于假手术组（P＜0.001）。CD53-中性粒细胞变化趋势与CD53+中性粒细胞相反。4、与假手术组比,MCAO小鼠外周血中性粒细胞TNFα-NFκB、IL6-Stat3、IFNα、IFNγ、IL2-Stat5等炎症反应相关信号通路,在脑缺血45min和再灌注I/R24h时明显激活（P＜0.05）,而在I/R72h时明显抑制（P＜0.05）。5、缺血后适应组与常规治疗组患者在入院及出院NIHSS评分上没有明显差异（P＞0.05）,在入院及出院3个月时m RS评分也没有明显差异（P＞0.05）。但缺血后适应组患者ΔNIHSS和Δm RS明显高于常规治疗（P＜0.05）。6、与对照个体比,常规治疗组脑梗死患者入院2d时外周血中性粒细胞比例明显上升（P＜0.01）,CD53+中性粒细胞比例也明显上升（P＜0.05）;常规治疗组脑梗死患者在入院5d和9d时外周血中性粒细胞与对照个体无明显差别（P＞0.05）,且明显低于入院2d时（P＜0.05）,而CD53+中性粒细胞仍明显高于对照个体（P＜0.05）,且与入院2d时无明显差别（P＞0.05）。与常规治疗组比,缺血后适应组患者CD53+中性粒细胞比例在远隔缺血后适应7d（入院9d）时明显下降（P＜0.05）。CD53-中性粒细胞变化趋势与CD53+中性粒细胞相反。结论:1、外周血中性粒细胞可以分为21个亚群,其中5个亚群（C4、C6、C14、C16、C18）属于中性粒细胞。5个亚群中性粒细胞又可以分为CD53+（包含C4、C14、C16、C18亚群）和CD53-（C6亚群）两大亚群。2、在功能上,CD53+亚群是一群促炎型中性粒细胞,而CD53-亚群是一群抗炎型中性粒细胞。3、脑缺血急性期,小鼠脾脏CD53+中性粒细胞释放入血,使外周血CD53+中性粒细胞明显增加,而远隔缺血预适应可能通过抑制这种变化减轻脑缺血再灌注损伤。4、急性脑梗死后患者外周血中性粒细胞明显增加且向CD53+亚群极化,经常规治疗后,外周血中性粒细胞比例降低,但仍处于向CD53+中性粒细胞极化的状态。而远隔缺血后适应可能通过抑制外周血中性粒细胞向CD53+亚群极化起到保护作用。