论文部分内容阅读
种子活力(Seed vigor)是指在广泛田间条件下,决定种子或种子批迅速整齐出苗和长成正常幼苗的潜在能力的种子特性,是衡量种子质量高低的重要指标之一。现有的种子活力检测方法,如ATP含量测定、酶活性的测定、发芽速度测定、幼苗生长测定等,可以准确、直观地评价种子活力,但其存在工作量大、成本高、效率低、速度慢、破坏种子等缺点。为了满足现代农业对活力检测技术快速、无损、准确的要求,新兴技术不断地被应用。直接质谱技术是近年来发展迅速、应用广泛的新型质谱技术。本文分别采用表面解吸化学电离质谱(Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization Mass Spectrometry,DAPCI-MS)和电喷雾萃取电离质谱(Extractive electrospray ionization Mass Spectrometry,EESI-MS)直接测定不同活力的咖啡和玉米种子样品,并通过主成分分析(PCA)、聚类分析(CA)和判别分析(DA)等多变量分析方法对其进行区分,实现了对咖啡和玉米种子活力的快速评价。主要研究内容及结果如下:1、采用人工加速老化法对种子进行处理,获得不同活力水平的咖啡和玉米种子,老化后的种子分别进行标准发芽实验、DAPCI-MS和EESI-MS,以未老化的种子为对照。2、通过标准发芽实验,明确了种子在老化过程中各项发芽指标和种子活力的变化规律。结果表明,未老化咖啡种子的发芽指标和活力指数与老化后的咖啡种子之间的差异极显著;未老化玉米种子的活力指数与老化后的玉米种子之间的差异极显著。随着老化时间的延长,种子的各项发芽指标和活力指数均呈下降趋势,咖啡种子老化到第6 d时和玉米种子老化到第14 d时,种子的各项发芽指标和活力指数均为0,说明种子在人工老化过程中,种子活力随着老化时间的延长而下降,直至完全丧失。对种子的各项活力指标与老化时间进行相关性分析,发现活力指标与老化时间都呈极显著的负相关关系,说明不同的老化时间使种子形成不同的活力水平。3、为了对不同活力的咖啡种子进行快速鉴别,采用DAPCI-MS直接对咖啡种子表面进行质谱检测,在正离子模式下,获得不同活力咖啡种子的质谱信息特征。在所有谱图中,m/z 100~400之间产生的质谱峰都很多,而在大于m/z 400处,质谱峰较少。信号峰m/z 55、274、302、318、400、473、489在所有咖啡种子样品中都有,其中m/z 274和318在所有样品中都是最强的,m/z 473的丰度在老化过程中呈现先增强后下降的趋势。将DAPCI-MS获得的实验数据通过多变量分析方法分析,结果表明,PCA提取了3个主成分,累计贡献率达到92.2%。CA可将相同活力的咖啡种子聚在一起,准确率为100%。DA对训练样本的回判正确率100%,交叉验证分析成功率100%,对外部验证样本进行DA,正确率100%。说明不同活力的种子之间存在一定的差异,因为咖啡种子中含有丰富的化学成分,在老化过程中这些物质或含量可能会发生变化。4、本文采用EESI-MS对咖啡种子的水提液进行检测,获得其正离子模式下的指纹图谱。从质谱图中可以看出,不同老化时间咖啡种子的谱图有较大的相似性,信号峰m/z 113、195、217等在所有谱图中均有较强的丰度。其中对m/z195[M+H]~+的离子进行串联质谱定性分析,根据特征碎片离子与参考文献对比,可推断其为咖啡因。将EESI-MS获得的实验数据通过多变量分析方法分析,结果表明,PCA提取了3个主成分,累计贡献率达到99.3%。CA可将相同活力的咖啡种子聚在一起,准确率为100%。DA对训练样本的回判正确率100%,交叉验证分析成功率100%,对外部验证样本进行DA,正确率100%。种子在老化过程中细胞膜会受到损伤,细胞内的可溶性物质发生渗漏,不同活力种子的细胞膜受到的损伤程度不同,可溶性物质渗漏的量也不一样,因此可采用该方法对种子活力进行测定。5、为了对不同活力的玉米种子进行快速鉴别,本文采用DAPCI-MS直接对玉米种子表面进行质谱检测,在正离子模式下,获得不同活力玉米种子的质谱信息特征。在所有谱图中,m/z 50~120之间产生的质谱峰都很多,且信号都比较强。在大于m/z 120处,未老化和老化2 d的玉米种子谱图中质谱峰较少,且信号较低;而在老化4 d以后的玉米种子的谱图中,质谱峰信号有所增强。信号峰m/z 73、87、100、116和362在所有玉米种子样品中都有,而且信号都比较强。通过多变量分析结果表明,PCA提取了3个主成分,累计贡献率达到85.4%。CA可将相同活力的玉米种子聚在一起,准确率为100%。DA对训练样本的回判正确率100%,交叉验证分析成功率98.7%,对外部验证样本进行DA,正确率100%。6、进一步采用EESI-MS对玉米种子的水提液进行检测,获得其正离子模式下的指纹图谱。m/z 104在未老化的玉米种子中信号最高,在老化2 d及以后的样品中信号都有所下降;m/z 113在未老化的玉米种子中信号较低,在老化2 d后的样品中明显升高,到老化10 d后又呈下降趋势;m/z 115在未老化至老化8 d的玉米种子中信号较低,从老化10 d开始信号明显增强。多变量分析结果表明,正离子模式下,PCA提取了3个主成分,累计贡献率达到62.9%。CA可将相同活力的玉米种子聚在一起,准确率为100%。DA对训练样本的回判正确率100%,交叉验证分析成功率100%,对外部验证样本进行DA,正确率100%。导致种子老化的原因包括膜完整性的丧失,能量代谢的减少,RNA和蛋白质的合成受损,DNA的降解等。种子老化过程中,其内部超微结构及代谢组学发生变化,并在表面形成相应的化学信号。直接质谱技术检测到的化学信息反映了种子老化过程中代谢产物的变化规律,不仅可对与种子活力相关的物质进行定性和定量分析,并且可对不同活力种子进行区分。本文利用DAPCI-MS与EESI-MS技术,获得不同活力咖啡和玉米种子的代谢组学信息,对样品的质谱行为进行了系统研究,建立了快速、灵敏、无损的种子活力检测方法,为种子的贮藏及种质资源的保存和定时更新繁殖提供参考依据。