妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus, GDM)是指妊娠期间首次发生或者首次发现的不同程度的糖耐量异常,是妊娠期最常见的并发症之一。随着人群和诊断标准的不同,GDM的发病率在1%-14%不等,每年有超过20万的GDM病例发生。中国人群GDM的发病率估计在5%左右。2013年,全球有超过2100万的活产婴儿受到了GDM的影响。GDM对孕妇和后代的健康风险贯穿在孕期、产后和整个生命过程中。GDM能够增加不良围产期事件的发生风险,这些不良事件包括妊娠期高血压、巨大儿、剖宫产和早产等。与此同时,GDM患者在产后数年之内更容易发展成2型糖尿病(Type2diabetes mellitus, T2DM)。母亲为GDM患者的儿童在童年和早期成年更容易发生肥胖和糖耐量受损。GDM的病因和发病机制较复杂,但已有研究显示年龄、糖尿病家族史、孕前肥胖等是GDM发病的危险因素。随着经济的发展和社会的进步,人们的饮食习惯发生了较大的变化,无论在中国还是西方,均由非加工、低能量、高纤维的食物向细加工、糖和脂肪含量较高的高能量食物转变。这种西化的生活方式,包括高能量膳食和低体力活动,已经无可争议地被认为与GDM的流行显著相关。因此,膳食方面的因素与GDM的关联性也得到了研究者的广泛关注。在众多的膳食因素中,膳食纤维(Dietary fiber, DF)引起了广泛的关注。有研究显示DF,尤其是谷物纤维的摄入能够明显的降低体重,而过度肥胖是目前影响GDM发病风险的最常见的可改变的因素之一。但是,目前国内外居民DF的摄入普遍低于推荐的摄入水平。在中国,DF的摄入量还呈现下降的趋势,来自谷物的纤维摄入量减少是DF呈现下降趋势的主要原因。近期一些人群流行病学调查也发现,全谷物食品摄入量较高与慢性疾病发病风险降低有关,当然这也包括GDM在内。虽然高的全谷物食品摄入对健康的促进作用的具体机制还未完全阐明,其含有的丰富的植物化学物和谷物纤维被认为在其中起到主要作用。因此,膳食纤维,尤其是谷物纤维的摄入与GDM的关联性研究显得迫在眉睫。Zhang及其课题组成员最先进行了上述研究,采用美国护士健康队列Ⅱ (Nurses’Health Study Ⅱ)的数据进行分析。经过年龄、产次、产前BMI和其他相关因素校正之后,总膳食纤维以及谷物和水果纤维的摄入量均与GDM的发病风险显著负相关。与此同时,营养流行病学的一个主要缺陷就是对于食物和营养素摄入量的测量精确度较低。如果使用一个有效的生物标志物来测量食物或者营养素的摄入量,同时结合膳食评估方法,可以补充和验证营养流行病学的相关方法。因此,寻找一个DF或者谷物纤维的可靠的生物标志物对于研究的进展可以起到至关重要的作用。烷基间苯二酚(Alkylresorcinols, AR)是一组带有奇数烷基侧链(17碳到25碳)的1,3-二羟基-5-烷基苯的衍生物,它们主要存在于小麦和黑麦的外侧部分。目前,已经在血浆和红细胞中检测到完整的AR同系物。AR代谢后产生的2种最重要的代谢产物3,5-二羟基苯甲酸(3,5-dihydroxybenzoic acid, DHBA)和3-(3,5-二羟基苯基)-1-丙酸(3-(3,5-dihydroxyphenyl)-propanoic acid, DHPPA)也已经在血浆和尿液中被检测到。进一步的研究发现DHBA和DHPPA的半减期远大于AR同系物的半减期,因此,样本采集时间对AR代谢产物的影响较AR同系物小,更适合应用在人群流行病学研究中。到目前为止,在中国人群中关于DF摄入与GDM的关联性研究还未见报道。因此,在以往研究的基础上我们拟在病例对照研究中探讨谷物纤维摄入与GDM患病风险的潜在关系,为了克服营养流行病学的缺陷,引入血浆AR代谢产物作为谷物纤维摄入的生物标志物。本研究主要包括以下三部分内容：第一部分液相色谱串联质谱联用定量检测血浆烷基间苯二酚的代谢产物目的：对原有的检测方法进行改进,建立一套灵敏度高、运行时间短的液相色谱-串联质谱方法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)对血浆AR代谢产物的水平进行同步检测。方法：采用Agilent1200高效液相色谱系统和配有电喷雾电离(Electrospray ionization, ESI)的Agilent6460三重串联四极杆质谱仪对被测物DHBA和DHPPA以及内标丁香酸(Syringic acid, SyrA)进行同步检测,优化样品前处理的方法及色谱和质谱条件来提高方法的灵敏度及各项指标。通过欧洲药品管理局的生物分析方法验证指南进行验证并且与高效液相色谱-库伦电极阵列检测(High-performance liquid chromatography with coulometric electrode array detection, HPLC-CEAD)的方法进行比较。结果：(1)优化后血浆样品的前处理只需进行酶解、萃取和浓缩复溶三个步骤。所需样品量为50μL,内标(SyrA)添加浓度为50ng/mL。DHBA在负离子模式下进行多反应监测(Multiple reaction monitoring, MRM),而DHPPA和SyrA在正离子模式下进行。DHBA、DHPPA和SyrA优化的定量质量转移离子对(m/z)分别为153.1→109.1、183.1→165.1和199.1→140.1。(2)方法学验证发现对血浆中AR代谢产物以及内标能够进行很好地分离,并且未出现内源性物质干扰。校准曲线线性相关系数大于0.999,定量下限(Lower limit of quantitation, LLOQ)达到0.4ng/mL。在不同的质控浓度下准确度均在85%-115%之间,精密度均<10%。DHBA和DHPPA的回收率也在90%-115%之间。(3)与HPLC-CEAD方法相比,样品用量减少,灵敏度提高并且运行时间缩短。结论：本部分建立的LC-MS/MS方法准确可靠,其灵敏度和运行时间得到较大改善,更适合应用到被测物水平较低的人群流行病学研究中。第二部分血浆烷基间苯二酚代谢产物与谷物纤维摄入的关系验证目的：探讨血浆AR代谢产物水平与谷物纤维摄入量之间的关系,确定在本研究中其是否可以作为谷物纤维摄入的一个潜在的生物标志物。方法：招募25名女性健康志愿者(年龄在20-35岁),遵循其日常的生活饮食规律。采用问卷调查表收集个人人口学资料并进行3天24小时膳食调查。调查结束次日清晨收集空腹血,同时进行体格检查。采用LC-MS/MS的方法检测血浆中AR代谢产物的水平。结果：(1)5名志愿者的数据因为能量摄入过少(<600kcal/d)而未被采用。研究对象的平均年龄为23.80岁,身体质量指数(Body mass index,BMI)为20.20kg/m2。谷物纤维的平均摄入量为1.66g/d。血浆DHBA.DHPPA和总的AR代谢产物(DHBA+DHPPA)的浓度分别为0.46(0.41-0.51)μg/L,1.40(1.11-2.23)μg/L和2.00(1.36-2.66)μg/L。(2)血浆DHBA水平与谷物纤维的摄入量无显著相关性(P>0.05)。在经过多因素校正之后,血浆DHPPA与谷物纤维的摄入显著正相关(r=0.568,P=0.043)。无论是否经过可能的混杂因素的调整,血浆总的AR代谢产物水平与谷物纤维的摄入量均存在显著的相关性(P<0.05),年龄、BMI、能量摄入和血脂水平在一定程度上加强了这种相关性(r=0.579,P=0.038)。(3)血浆DHBA.DHPPA以及总的AR代谢产物与总的膳食纤维及蔬菜水果纤维的摄入未见显著相关关系(P>0.05)。结论：血浆总的AR代谢产物与谷物纤维的摄入具有显著的相关性,这种相关性在调整了可能的混杂因素后依然显著。因此,在本研究中其可以作为谷物纤维摄入的一个潜在的生物标志物。第三部分血浆总的烷基间苯二酚代谢产物作为谷物纤维摄入的生物标志物与妊娠期糖尿病的关联研究目的：比较GDM患者和对照人群血浆样本中AR代谢产物水平的差异,探讨其与脂代谢等其他指标之间的相关性和与GDM的关联性。评价AR代谢产物水平对GDM患病的筛检效果的影响,以此反映谷物纤维的摄入与GDM患病风险的关系。方法：研究对象为2012年8月至2013年3月在华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌实验室进行口服糖耐量试验(Oral glucose tolerance test,OGTT)的所有符合条件的孕妇。根据ADA2011诊断标准将其分为GDM病例组和对照组。采用问卷调查表收集个人人口学资料(年龄、胎龄、产次等)、吸烟饮酒状况、疾病史和糖尿病家族史等信息。收集血样测定血糖、血脂水平,采用LC-MS/MS的方法检测血浆AR代谢产物的水平。结果：(1)本研究共纳入GDM病例66例,经年龄、胎龄和居住地匹配的对照66例。GDM患者的产前BMI和糖尿病家族史的分布比率显著高于对照组,而年龄、胎龄、血脂水平、吸烟率、饮酒率以及高血压患病率在两组间未见明显差异。(2)血浆总的AR代谢产物水平在GDM病例组和对照组分别为4.58(3.35-6.02)μg/L和5.95(4.80-7.89)μg/L,差异具有统计学显著性(P<0.001)。(3)血浆总的AR代谢产物水平与空腹血糖(Fasting plasma glucose,FPG)水平显著相关。(4)随着血浆总的AR代谢产物水平的提高,GDM的患病风险逐渐降低。经过年龄、胎龄、产前BMI、吸烟饮酒状况、高血压患病状况、糖尿病家族史和血脂水平的校正之后,血浆总的AR代谢产物的水平每增加1μg/L,GDM的患病风险降低37.0%。根据对照组人群血浆总的AR代谢产物的水平进行二分位划分后,较高组人群患GDM的风险与较低组比较显著降低。经过多因素校正之后,其OR值为0.329(95%CI0.146-0.742；P for trend=0.007)。(5)将血浆总的AR代谢产物水平加到一个常规模型(包括年龄、产前BMI、吸烟、饮酒、高血压患病情况、糖尿病家族史和血脂水平)中之后,AUC值从0.702(95%CI0.612-0.791)增加到0.779(95%CI00.701-0.857),差异有统计学意义(P=0.048)。结论：GDM患者血浆总的AR代谢产物水平较对照组显著降低。血浆总的AR代谢产物水平与GDM具有较强的关联性,呈现一定的剂量效应关系。在进行可能的混杂因素校正后这种关联性仍然存在。以上结果提示我们谷物纤维的摄入量与GDM的患病风险存在一定的关联性。本研究的创新点：1、在原有方法的基础上建立了一套灵敏度高、运行时间短的LC-MS/MS的检测方法,并且首次把它应用到人血浆AR代谢产物的检测中。2、在本研究中验证了血浆AR代谢产物与谷物纤维摄入的相关性,并且发现血浆总的AR代谢产物可以作为谷物纤维摄入的一个潜在的生物标志物。3、首次把血浆AR代谢产物水平作为谷物纤维摄入的一个潜在的生物标志物应用到GDM的病例对照研究中,通过其与GDM患病风险的关系来反映谷物纤维摄入与GDM之间的关联性。本研究的不足和后续研究计划：1、已有研究者在红细胞等组织中检测到了AR同系物或其代谢产物。红细胞中AR同系物或代谢产物的水平是否可以作为谷物纤维摄入的生物标志物有待进一步研究。2、GDM病例对照研究所纳入的样本量较小,还需在更大样本量的研究中进行验证。与此同时,病例对照研究无法阐明因果关系,在队列研究中进行上述关系的探索也亟需进行。3、GDM病例对照研究中缺少膳食调查的数据,无法分析膳食调查数据与生物标志物检测数据的相关性,也无法将两者相结合起来确定膳食营养素的摄入量与GDM的关系。因此,在今后的研究中建议同时进行膳食调查和生物标志物水平的检测,探讨哪种方法能够更好的确定膳食营养素的摄入量并将其应用到疾病研究之中。4、鉴于血浆AR代谢产物与谷物纤维摄入的显著关联性,建议在今后的研究中将其应该到2型糖尿病等其他疾病的分析之中。