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精子发生(spermatogenesis)是一个高度复杂而有序的过程,在这一分化过程中,细胞特异性和发育阶段特异性基因的转录和表达受到严格的时空调控。大量细胞特异性和发育阶段特异性蛋白质合成并被准确降解,以保证精子发生的顺利进行。研究表明,泛素系统在整个精子发生过程中都发挥着非常重要的作用,包括有丝分裂、减数分裂、染色质重塑、DNA损伤修复和细胞凋亡等过程。最近研究发现,泛素化除了蛋白酶体降解之外,还具有一些新的功能,如调节蛋白质活性和亚细胞定位等。研究表明,泛素系统通过非蛋白质降解的功能,参与细胞内蛋白质功能的调控,进而影响细胞发育、凋亡、衰老等生命过程。本室梁刚博士利用激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection,LCM)技术结合抑制性消减杂交(Suppressive Subtractive Hybridization,SSH)方法构建了人圆形精子细胞消减初级精母细胞cDNA文库。根据人初级精母细胞特异EST,设计引物,以人睾丸cDNA文库为模板进行PCR扩增,得到人睾丸组织中表达的新基因,其中一个命名为HSD-34,于2004年9月将序列提交GenBank,登录号为AY305385。HSD-34 cDNA序列全长1544bp,具有1503bp的开放阅读框,编码500个氨基酸,定位于人类15号染色体(Location:15q21.1),GeneID为140691。HSD-34与其小鼠同源物氨基酸序列的同源性高达91%,HSD-34小鼠同源物在小鼠睾丸、心脏、肝脏和脑组织中均有较高的表达。结构域分析提示,HSD-34蛋白N-末端41-82位氨基酸残基构成RING finger结构域,110-144位氨基酸残基构成B-box结构域,175-195位和226-253位氨基酸残基构成coiled-coil结构域,C-末端305-500位氨基酸残基构成B30.2结构域,即HSD-34具有RING finger-B-box-coiled-coil(RBCC)三个连续的结构域,因此,该蛋白质属于TRIM/RBCC蛋白质家族成员。2006年底,GenBank将HSD-34及其同源基因(RNF36,Trif)统一命名为TRIM69。RING finger结构域在介导泛素分子转移到特异底物和RING蛋白质自身的过程中发挥关键的作用。因此,RING结构域是很多泛素连接酶E3的特征性标志。而泛素连接酶E3具有自身泛素化的特性。我们将HSD-34的RING finger结构域中半胱氨酸残基(Cys)或组氨酸残基(His)进行突变,构建了一系列点突变体,进行体内(in vivo)泛素化实验。结果证明,HSD-34具有自身泛素化作用,是一个新的泛素连接酶E3;同时表明,RING finger结构域是其发挥催化功能的活性结构域;C61和C64是RING结构域的关键位点。构建了去除RING结构域(ARING),去除RING-B-box结构域(ARING-B),保留N-端RBCC结构域(RBCC)和C-端B30.2结构域(B30.2)的缺失体。进行体内泛素化实验,进一步证实RING结构域是HSD-34泛素连接酶E3的活性结构域。通过酵母双杂交实验,筛选HSD-34的相互作用蛋白质。为了防止HSD-34发生自激活,以N-端去除RING finger结构域(即1-246bp)的序列作为诱饵基因,进行酵母双杂交筛选,得到4个阳性克隆,分别是:细胞周期检验点Hus1蛋白(GenBank登录号为NM-004507);参与细胞骨架actin组装的RhoE蛋白(GenBank登录号为NM-005168);Bcl-2家族A1蛋白(Bcl-2A1)(GenBank登录号为NM-004049);以及白细胞介素2受体β蛋白(IL-2RB)(GenBank登录号为NM-000878)。文献报道,HSD-34小鼠同源基因可以诱导细胞发生凋亡。对四个阳性克隆的生物信息学分析表明,细胞周期检验点Hus1蛋白,在细胞内与另外两个细胞周期检验点蛋白Rad9和Rad1形成Rad9-Hus1-Rad1(9-1-1)复合物,作为细胞周期G2/M期检验点,参与细胞DNA损伤修复和细胞凋亡的调控,并且Hus1蛋白在人睾丸组织中高表达,因此,我们选择Hus1蛋白进行深入研究。通过免疫共沉淀方法证明了HSD-34蛋白与Hus1蛋白在细胞内存在相互作用;细胞免疫荧光结合激光共聚焦扫描结果显示:HSD-34蛋白与Hus1蛋白在HeLa细胞内共定位。进一步证实了二者的相互作用关系。HSD-34蛋白在细胞浆和细胞核中均有分布,细胞浆中主要定位于细胞核周围,呈环状聚集;在细胞核中呈散点状分布;ARING缺失体聚集于整个细胞膜周围;ARING-B缺失体在整个细胞膜上聚集的趋势更加显著,并在细胞膜上伸出丝状细小伪足;B30.2缺失体在细胞膜周围分布;RBCC缺失体部分恢复HSD-34在细胞浆中的聚集现象,但边界不清晰;C61A/C64A突变体弥漫分布于整个细胞中,完全失去了HSD-34蛋白的定位特点。以上结果提示,RING finger结构域对于HSD-34蛋白在细胞内的定位起重要作用。HSD-34对外源性和内源性Hus1蛋白的降解实验,表明HSD-34不参与Hus1蛋白的蛋白酶体降解。HSD-34转染HeLa细胞,引起内源性Hus1蛋白和磷酸化Hus1蛋白表达显著上调;同时激活caspase-3,导致细胞凋亡。提示,HSD-34对Hus1蛋白的功能具有特异的调节作用。应用Hoechst33258进行细胞核染色,观察到转染HSD-34后,细胞发生核浓缩,出现明显的细胞凋亡现象。荧光显微镜观察到GFP-HSD-34融合蛋白在胞浆呈花环状分布或在核周两极聚集成括号状;然后转入胞核内,引起细胞核浓缩、碎裂。推测:HSD-34蛋白在细胞质中合成,然后穿梭进入细胞核,最终在细胞核内发挥促进细胞凋亡的作用。转染HSD-34后,检测不同时间点细胞在分子水平上的改变。发现1)转染后12h,检测到HSD-34蛋白的表达,并呈现表达增加的趋势;同时,检测到活化的caspase-9和caspase-3的表达,且二者在该时间点表达量最高,随后逐渐降低;2)实验组12h检测到磷酸化的Hus1蛋白的表达,随着时间的延长,表达量显著增加,且与HSD-34表达趋势一致;3)实验组和对照组中,p53蛋白的表达没有发生显著变化。应用PathDetect(?)顺式报告系统,检测HSD-34对NF-κB,NFAT,CRE,AP1,STAT1细胞信号转导通路的影响。结果显示:HSD-34可以激活CRE细胞信号转导通路。综上结果,我们推测,HSD-34蛋白通过线粒体介导的细胞凋亡通路,活化caspase-9,caspase-3;同时在细胞核内,激活CRE信号通路,使Hus1蛋白表达上调,由于HSD-34与Hus1蛋白存在相互作用,催化Hus1蛋白发生磷酸化修饰,磷酸化的Hus1蛋白进一步活化细胞凋亡通路,最终导致凋亡的发生,而这一过程不依赖于p53蛋白的活化。