论文部分内容阅读
自2015年我国农业部提出马铃薯主粮化战略以来,我国马铃薯种植面积和产量不断扩大,目前均位居世界第一位,我国已成为马铃薯生产和消费的第一大国。然而,由致病疫霉引起的晚疫病被公认为是世界第一大作物病害,每年都会给马铃薯产业造成巨大损失,严重制约着马铃薯产业的发展。当前,马铃薯生产中主要采用喷洒化学农药或培育抗病品种等方式来防治马铃薯晚疫病,但是化学农药的长期大量使用,使致病疫霉产生了抗药性;同时,化学农药的过度使用,已经对大自然和人类的生存环境造成了巨大的污染,时刻威胁着人类的身体健康。培育抗病品种成本高、耗时长,抗病品种培育的速度远远不及病原菌的变异速度。寻求更加安全高效的防治手段已成为马铃薯产业发展的关键。生物防治因其高效环保的优势,在防治植物病害方面一直有着巨大的潜力。利用致病疫霉拮抗菌及其代谢产物来防治马铃薯晚疫病已成为研究的热点。目前,针对致病疫霉及其马铃薯晚疫病的研究,主要集中在拮抗菌的菌株筛选、鉴定、抑菌活性鉴定、抑菌物质的分离纯化、离体组织和盆栽植株防病效果检测等方面,对于拮抗菌抑制致病疫霉的生理生化机制以及拮抗菌与致病疫霉之间的感应现象研究较少。对受拮抗菌抑制后病菌体内生理生化变化的了解以及拮抗菌与致病疫霉之间相互关系的深入研究,不仅有助于揭示拮抗菌与病菌之间的相互作用机理,为高效利用拮抗菌及其产物防治病害提供试验依据,更能为卵菌群体感应研究提供新的认知和研究思路。本实验室在前期研究中从种植番茄的土壤中筛选出一株对致病疫霉有显著抑制作用的放线菌Sy11（经鉴定为细黄链霉菌）,活体对致病疫霉菌丝体生长具有极强的抑制效果,且菌液抑菌稳定性很强,但其无菌体发酵液对致病疫霉菌丝体生长无丝毫抑制效果。进一步研究发现,Sy11菌株与致病疫霉两者间存在一种诱导感应现象,只有在致病疫霉存在时,Sy11菌株才会产生抑菌物质来抑制致病疫霉的生长。据此推测,致病疫霉与Sy11菌株对峙培养时会分泌一种信号分子,当Sy11菌株感应到这种信号分子后就会产生抑制致病疫霉生长的物质。但是,对于两者之间的这种感应现象还缺乏深入的了解和认知。本试验研究在本实验室前人研究工作基础上,主要解决以下问题:（1）通过对放线菌Sy11引起致病疫霉菌丝体及孢子囊形态畸变的显微观察以及受抑制的致病疫霉菌丝体内可溶性糖、蛋白质、MDA、防御性酶和相关能量代谢酶酶活变化的检测,与正常生长的致病疫霉菌丝体相对比,初步探讨Sy11菌株抑制致病疫霉的生理生化机制;（2）对Sy11菌株与致病疫霉间的诱导感应现象进行进一步的验证和研究,明确致病疫霉信号分子的产生方式和对Sy11菌株的诱导方式;（3）对致病疫霉产生的信号分子进行初步分离提取,明确信号分子的产生场所及浓度与诱导效果的关系;（4）对信号分子粗提物的生理生化性质进行初步研究,并对其主要的化学成分进行初步化学检识,为明确信号分子的物质结构、进一步分离纯化信号分子、揭示具体的诱导感应原理提供理论基础。本研究获得的主要研究成果如下:1、无论是Sy11活体菌株还是经一定条件培养的菌液对致病疫霉的生长均有较强的抑制效果,抑制率均到了85%以上。对Sy11菌株与致病疫霉对峙培养过程中产生的抑菌物质的分析表明,该物质易溶于乙酸乙酯,对致病疫霉菌丝体生长也有较强的抑制效果,抑制率达到了55.67%。统计分析表明,经过Sy11抑菌物质处理后,致病疫霉游动孢子释放率仅为19.53%,孢子囊直接萌发率也仅为13.6%,与对照组（分别为37.03%和35.46%）相比均存在显著性差异（P<0.05）。在对受到抑制作用后的菌丝体及孢子囊进行显微观察时发现,致病疫霉菌丝体发生了明显的畸变,主要表现为表面粗糙、分枝过多、内含物分布不均匀或外溢、直角弯曲等,菌丝体细胞壁遭到了严重破坏,孢子囊经过长期的抑制后,内含物的分布发生了明显变化,中央稀少甚至没有,主要分布在四周,整个孢子囊呈现为“大眼睛”结构。2、致病疫霉在受到Sy11菌株抑制作用后,与未受抑制的菌丝体相比,其菌丝体内可溶性糖及蛋白质含量均有明显的降低,丙二醛的含量却显著提高。在对菌丝体内防御性酶酶活检测中发现,与对照相比超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）这三种酶含量均有明显升高,而与糖酵解、TCA循环及能量代谢相关的己糖激酶（HK）、琥珀酸脱氢酶（SDH）及三磷酸腺苷酶（ATP）这三种酶的酶含量均显著降低,其中三磷酸腺苷酶（ATP）酶含量降低幅度最大,与正常组相比下降了88.99%。3、致病疫霉在单独培养或与Sy11对峙培养时均会产生一种信号分子,该信号分子会随着致病疫霉的生长在培养基中向四周扩散,当Sy11菌株感应到这种信号分子后就会立刻产生抑菌物质从而抑制致病疫霉的生长。通过对致病疫霉产生的信号分子进行分析发现,该信号分子不属于蛋白质类或多糖类物质,应该属于脂类物质或至少以脂类物质为主,且易溶于乙酸乙酯。4、致病疫霉产生的信号分子有效成分的分子量在1 00014 000 D之间。采用不同试剂沉淀、萃取比较后发现,无水乙醇预处理后,再用乙酸乙酯直接萃取的方式对致病疫霉发酵液中信号分子的提取效果最好。萃取得到的浓缩液经过丙酮溶液重结晶后得到了信号分子粗提物,为红、黄褐色呈油状的脂类物质。5、信号分子粗提物对高温（90℃及以上）、极端酸碱（pH<6,pH>8）较为敏感,但对紫外线和蛋白酶处理不敏感,在有Cu2+或Zn2+离子存在情况下,其活性会明显下降,可能由于信号分子与Cu2+、Zn2+形成了螯合物,影响了其活性。信号分子的活性灵敏,在较低浓度下（稀释105后）对Sy11菌株有诱导活性,诱导后Sy11菌株对致病疫霉菌丝生长的抑制率为71.09%。6、致病疫霉产生的信号分子,既存在于胞内溶液也存在于胞外溶液,且在菌丝体、孢子囊和游动孢子等不同生长发育阶段均可产生,这三者的萃取液对Sy11菌株均有一定的诱导活性,且诱导后的抑制率均达到了70%以上。7、对致病疫霉信号分子粗提物的主要成分进行化学检识后,初步认为该信号分子的有效成分是一种复合物,其中含有挥发油、蒽酮及苷类、有机酸和氨基酸等化合物。