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位点-2蛋白酶（Site-2 protease,S2P）作为一种在大多数细菌中存在的金属蛋白酶,在可调节的膜内蛋白酶解中发挥重要作用。赤红球菌（Rhodococcus ruber）中关于S2P类似蛋白作用何种底物未见报道,其底物参与的信号转导途径并不清楚。筛选赤红球菌SD3菌株S2P类似蛋白底物并进行功能分析,为进一步揭示赤红球菌SD3中蛋白酶解所涉及的信号转导途径奠定基础,同时为赤红球菌SD3的遗传改造提供潜在的靶标。本论文的主要研究内容和结果如下:1.利用分子对接的方法在赤红球菌SD3中筛选S2P类似蛋白的底物,克隆底物蛋白基因,并进行生物学信息分析。通过筛选发现S2P类似蛋白的一种底物可能为一个组氨酸激酶（Rhodococcus ruber Histidine Kinase,RHK）。该基因在Gen Bank中的序列登录号为MN688330。它的开放阅读框长为1410 bp,编码469个氨基酸,其对应蛋白的理论分子量为49.62 k D,信号肽存在几率为0.6765,信号肽锚定几率为0.2113,信号肽的切割位点位于35～36位氨基酸之间。该蛋白属于不稳定疏水性蛋白,同时有3个明显的疏水峰,没有二硫键,含有1段跨膜区,二级结构主要以α螺旋为主,亚细胞定位表明组氨酸激酶在细胞膜上发挥生物学作用。组氨酸激酶的第164～455位氨基酸之间包含多种保守结构域,属于多种超家族。并通过Robetta建模工具得到了蛋白的三级结构。进化树分析表明Rhodococcus ruber SD3和Rhodococcus pyridinivorans SB3094的组氨酸激酶聚为一簇。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q PCR）分析表明在甲苯和苯酚的胁迫下,组氨酸激酶的表达分别下调到对照样品的0.76倍和0.78倍。2.研究了赤红球菌SD3中组氨酸激酶融合蛋白的催化活性和动力学行为。对rhk基因进行序列分析,发现其稀有密码子较多,GC含量较高,存在一些重复序列。为了在大肠杆菌中进行高表达,于是对赤红球菌的rhk基因进行密码子优化,将优化后的基因命名为rhks,并构建重组表达质粒p GEX-4T-2-rhks。将此质粒导入到大肠杆菌BL21（DE3）感受态进行异源表达,并进行表达条件的优化。在25℃和1 m M IPTG诱导条件下,RHK融合蛋白获得成功表达,并具有催化活性。经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化,获得电泳纯的GST-RHK融合蛋白,其中纯化倍数为3.1,得率为19.5%。该蛋白大小约为72.75 k D,与理论值72.17 k D基本一致,经过LC-MS/MS分析进一步证实该蛋白为目的蛋白。GST-RHK融合蛋白的动力学分析表明该蛋白的Km、Vmax和Kcat值分别为20.92μM、0.17μM/min和1.4 min-1。3.为研究赤红球菌SD3中rhk基因与菌株有机溶剂耐受性之间的关系,对赤红球菌SD3中rhk进行基因增强和基因敲减,获得rhk基因增强株sdrhk E和rhk基因敲减株sdrhk D。通过q PCR分别研究菌株sdrhk E与菌株sdrhk D中的rhk基因在转录水平表达量变化情况,结果表明菌株sdrhk E中rhk基因表达上调到对照样品的46.57倍,菌株sdrhk D中rhk基因表达下调到对照样品的0.05倍。在分别含有苯酚、甲苯、氯苯、异辛烷四种有机溶剂的培养基中培养,菌株sdrhk D的生长情况都优于野生型赤红球菌,菌株sdrhk E的生长情况都略低于野生型赤红球菌。结果暗示rhk基因的下调可能使菌株的有机溶剂耐受性增加,而rhk基因的上调使菌株有机溶剂耐受性下降。总之,本研究通过分子对接筛选到S2P类似蛋白的底物为组氨酸激酶,异源表达得到有活性的组氨酸激酶融合蛋白,并确定了组氨酸激酶与赤红球菌有机溶剂耐受性之间的关系,为进一步揭示赤红球菌SD3中蛋白酶解所涉及的信号转导途径与赤红球菌有机溶剂耐受性的关联机制奠定基础。