抗生素是目前世界上使用最广泛的药物之一,其杀死细菌的作用原理是:抑制细胞壁的合成,改变细胞膜的通透性,抑制核酸复制转录以及干扰蛋白质的合成。除应用于临床医疗外,抗生素还被广泛的应用到农业和养殖业,为人类社会的发展做出了极大的贡献。但抗生素的过量使用导致大量未降解的抗生素进入到水体中。环境中残留的抗生素可以通过食物链的富集作用进入到人体中,引起人体的过敏反应并诱导产生抗性基因,对人类的健康带来了极大的威胁。当前,传统的检测手段受到各种条件的制约,使得抗生素的残留检测繁琐低效。因此,迫切需要发展一种高效、灵敏的方法来检测环境中的痕量抗生素。在此,我们构建了一种基于G-四联体DNAzyme并结合多种等温信号扩增手段的电化学生物传感器来检测环境中的痕量抗生素。本研究利用核酸适配体和等温信号扩增技术构建的电化学生物传感器对目标抗生素表现出高特异性和高灵敏度,并且可以应用于对实际样品的检测。主要研究内容如下:内容一:本研究将劈开的G-四联体DNAzyme做为一个信号分子整合到电化学传感平台中实现了对卡那霉素的高特异性和高灵敏性检测。为了提高信噪比,我们将两个富含鸟嘌呤(G)的寡核苷酸序列(G1和G2)分别封闭在两个不同的发卡探针中,以防止这两个片段组装成G-四联体结构。同时,我们将包含适配体的双拱探针作为识别元件,并设计两步酶促反应作为信号扩增策略。具体地,第一步信号扩增是通过目标物—适配体的结合而激活的Nt.BbvCI酶辅助的循环反应,第二步是通过Exonuclease III(Exo III)辅助的循环扩增来产生大量的G1和G2。电极上修饰的捕获探针用于结合G1和G2,当钾离子和血红素存在时形成G-四联体/血红素复合物。该复合物有着辣根过氧化物酶的特性并且可以催化过氧化氢分解。在最佳实验条件下,该生物传感器展现出了对卡那霉素检测的卓越性能,检测限低至83 fM,检测范围为100 fM至1 nM。内容二:本策略是将Exo III驱动的DNA walker机器应用到电化学生物传感器平台的构建,实现了氨苄青霉素的无标记高灵敏检测。在金电极表面上修饰富含鸟嘌呤序列的DNA轨道(DT)以及由DNA Walker(DW)和挂锁探针(LP)杂交成的双链探针。氨苄青霉素和适配体特异性的识别触发了Exo III辅助的循环扩增反应,释放了可以解锁DW的解锁探针(UP)。然后,伴随着Exo III的消化驱动,DW在电极表面上的自由移动并与DT杂交。DT被消化后可以形成G-四联体/血红素复合物,该复合物可以催化H2O2的还原,产生明显的电流信号。此次构建的生物传感器可以实现在1 pM至10 nM的范围内检测氨苄青霉素,最低检测限为0.76 pM。此外,该生物传感策略通过使用相应目标物识别探针,可以检测多种目标物。内容三:我们将一个熵驱动的DNA walker机器整合到电化学传感平台,用于对氨苄青霉素的无标记检测。据我们所知,这项工作是第一次将熵驱动的DNA机器用于抗生素检测。该DNA walker机器的启动依赖于目标物诱导的催化发卡自组装形成拼接式DNA walker长臂。通过toehold介导的链置换反应实现自主移动的拼接式DNA walker长臂诱导信号探针从三链DNA复合物上持续离解。释放的信号探针最后生成了大量的G-四联体DNAzyme,催化H2O2还原产生明显的电流信号。归功于熵驱动和无标记的策略,本研究构建的拼接式DNA walker机器对氨苄青霉素的最低检测限为0.96 pM,并且在经济性和稳定性方面优于之前报道的DNA walker机器。此外,本研究设计的DNA walker机器可以使用相对应的目标物识别探针来检测各种分析物。