论文部分内容阅读
第一部分P300介导的组蛋白乙酰化对GATA4表达的调控机制研究目的:GATA4(GATA binding protein 4,GATA结合蛋白4)作为一种重要的心脏相关转录因子,可通过调控下游靶基因cTnI表达参与心脏发育。我们前期研究发现,启动子区组蛋白低乙酰化可以抑制心肌细胞中GATA4的表达,但其发生的具体机制尚不清楚。本实验通过下调组蛋白乙酰转移酶P300,观察其对GATA4启动子区组蛋白乙酰化水平及GATA4基因转录的影响,以期揭示组蛋白乙酰化调控GATA4表达的机制。方法:(1)体外培养心肌祖细胞,分为空白组、阴性对照组和P300干扰组,分别不处理、转染空载体慢病毒和转染P300 siRNA慢病毒;(2)流式细胞术检测转染效率;(3)RT-qPCR检测P300、GATA4及Tbx5 mRNA水平;(4)CHIP-qPCR检测GATA4启动子区组蛋白H3整体的乙酰化和组蛋白赖氨酸位点H3K4、H3K9及H3K27乙酰化水平,以及组蛋白修饰酶P300、CBP、PCAF与GATA4启动子区结合水平。结果:(1)病毒转染48h后,心肌祖细胞生长状态良好,阴性对照组及P300干扰组转染效率分别为62.6%和73.7%;(2)P300干扰组P300及GATA4 mRNA表达水平较阴性对照组明显降低(P<0.05),Tbx5mRNA表达水平较阴性对照组无差异(P>0.05);(3)P300干扰组GATA4启动子区组蛋白H3整体的乙酰化和组蛋白赖氨酸位点H3K4、H3K9及H3K27乙酰化水平较阴性对照组明显降低(P<0.05),Tbx5启动子区组蛋白H3整体的乙酰化和组蛋白赖氨酸位点H3K4、H3K27乙酰化水平较阴性对照组明显降低(P<0.05),而H3K9乙酰化水平较阴性对照组明显增高(P<0.05);(4)P300干扰组P300与GATA4启动子区结合水平较阴性对照组明显降低(P<0.05),CBP及PCAF与GATA4启动子区结合水平较阴性对照组明显增高(P<0.05)。结论:(1)P300介导的组蛋白乙酰化参与GATA4基因表达的调控;(2)GATA4启动子区H3K4、H3K9和H3K27的乙酰化可能在GATA4基因表达的调控中发挥重要作用。第二部分HDAC1介导的组蛋白去乙酰化对cT nI表达的调控机制研究目的:我们前期研究发现组蛋白乙酰化参与心脏结构蛋白cTnI(cardiac troponin I,肌钙蛋白I)基因表达的调控,且HDAC1可能在其中发挥重要作用,但其发生的具体机制尚不清楚。本实验通过下调组蛋白去乙酰化酶HDAC1,观察其对cTnI启动子区GATA元件组蛋白乙酰化及c TnI基因转录的影响,以期揭示HDAC1调控cTnI表达的机制。方法:(1)体外培养心肌原代细胞,分为空白组、阴性对照组和HDAC1干扰组,分别不处理、转染空载体腺病毒和HDAC1 siRNA腺病毒;(2)RT-qPCR检测HDAC1、cTnI及RPL13A mRNA水平;(3)Western Blot检测c TnI蛋白水平;(4)CHIP-qPCR检测HDAC1与cTnI启动子区GATA元件结合水平,cTnI启动子区GATA元件组蛋白H3整体的乙酰化和组蛋白赖氨酸位点H3K4、H3K9及H3K27乙酰化水平,以及GATA4与cTnI启动子区GATA元件结合水平。结果:(1)病毒转染48h后,心肌原代细胞生长状态良好,HDAC1干扰组HDAC1 mRNA表达水平较阴性对照组降低(P<0.05);(2)HDAC1干扰组HDAC1与c TnI启动子区GATA元件结合水平较阴性对照组降低(P<0.05);(3)HDAC1干扰组cTnI mRNA及蛋白表达水平较阴性对照组明显增高(P<0.05);(4)HDAC1干扰组cTnI启动子区组蛋白H3整体的乙酰化和组蛋白赖氨酸位点H3K4及H3K9乙酰化水平较阴性对照组明显增高(P<0.05),而H3K27乙酰化水平较阴性对照组无差异(P>0.05);(5)HDAC1干扰组GATA4与cTnI启动子区GATA元件结合水平较阴性对照组增高(P<0.05)。结论:(1)HDAC1介导的组蛋白去乙酰化参与cTnI基因表达的调控;(2)HDAC1介导的cTnI启动子区H3K4、H3K9乙酰化可能在cTnI基因表达的调控中发挥重要作用;(3)HDAC1介导的组蛋白去乙酰化可调控转录因子GATA4与cTnI启动子区GATA元件结合,进而影响cTnI基因表达。第三部分组蛋白乙酰化对cTnI低表达及舒张功能障碍的作用目的:c TnI与心脏正常舒张功能的维持关系密切。第二部分证实组蛋白乙酰化可通过募集GATA4结合到cTnI启动子区调控cTnI表达。本实验通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他(vorinostat)抑制cTnI启动子区组蛋白去乙酰化,上调组蛋白乙酰化,验证其对cTnI低表达和老年小鼠舒张功能障碍的影响。方法:(1)以15月龄老年雌鼠为研究对象,分别给与生理盐水(NS),二甲基亚砜(DMSO)和伏立诺他(vorinostat)皮下注射7天;(2)超声心动图检测小鼠心功能;(3)RT-qPCR和Western Blot检测cTnI mRNA和蛋白的表达变化(;4)CHIP-qPCR检测HDAC1与cTnI启动子区GATA元件结合水平,cTnI启动子区GATA元件组蛋白H3整体的乙酰化和组蛋白赖氨酸位点H3K4、H3K9及H3K27乙酰化水平,以及GATA4与cTnI启动子区GATA元件结合水平。结果:(1)Vorinostat组E/A比值较对照组增高(P<0.05),HR、IVSd、PWd、LVEDD、IVSs、PWs、LVESD、FS以及EF较对照组无明显变化(P>0.05);(2)Vorinostat组cTnI mRNA及蛋白表达水平较阴性对照组明显增高(P<0.05);(3)Vorinostat组HDAC1与cTnI启动子区GATA元件结合水平较阴性对照组降低(P<0.05);(4)Vorinostat组cTnI启动子区组蛋白H3整体的乙酰化和组蛋白赖氨酸位点H3K4及H3K9乙酰化水平较阴性对照组明显增高(P<0.05),而H3K27乙酰化水平较阴性对照组无差异(P>0.05);(5)Vorinostat组GATA4与cTnI启动子区GATA元件结合水平较阴性对照组增高(P<0.05)。结论:(1)组蛋白H3K4及H3K9乙酰化可能参与募集GATA4到cTnI启动子区GATA元件,促进cTnI基因表达;(2)组蛋白乙酰化可募集GATA4到cTnI启动子区GATA元件,促进cTnI基因表达,改善cTnI低表达老年小鼠心功能。