脑卒中是一种急性脑血管疾病,指由于脑部血管破裂出血或各种原因导致血管阻塞,血液不能正常供应,进而引起脑组织损伤。根据发病机制的不同可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中,其中缺血性脑卒中是我国最常见的卒中类型,约占所有脑卒中总数的69.6%-70.8%。在我国脑卒中呈现出高发病率、高致残率、高复发率、高死亡率和高疾病负担等五大特点,而且随着我国人口老龄化和社会城镇化进程的加速,脑卒中危险因素日益流行,导致脑卒中的疾病负担逐年增加。因此,积极开发安全有效的治疗药物,对于防治缺血性脑卒中意义重大。丹参-葛根作为药对,始载于《施今墨对药》中,二者配伍使用,相互促进,可活血化瘀,祛瘀生新。在长期的临床实践中二者也常作为药对或者核心药对出现于临床治疗脑卒中的制剂（如通脉颗粒、丹灯通脑胶囊、丹参葛根元胡片）中,在防治心脑血管疾病方面发挥着重要作用。现代药理研究亦表明丹参-葛根药对在心肌缺血、动脉粥样硬化、高脂血症和糖尿病等方面有较好的药理作用,但目前两者配伍治疗缺血性脑卒中的研究较少。本课题组前期研究发现丹参-葛根提取物有良好的体外抗氧化活性,而氧化应激是引起脑缺血再灌注损伤的关键环节之一,可引发缺血再灌注损伤后下游的一系列病理生理反应,包括炎症反应、细胞凋亡、神经元损伤和血脑屏障破坏等,因此,丹参-葛根提取物能否在缺血性脑卒中的发生发展中起到保护作用值得深入研究。基于此,本文从以下四部分探究丹参-葛根提取物对缺血性脑卒中的保护作用,并初步探讨可能的作用机制。第一部分丹参-葛根药对配伍比例筛选及活性成分分析目的:选取经典的氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤模型筛选丹参-葛根药对配伍比例,采用HPLC法分析不同配伍比例丹参-葛根药对的活性成分。方法:采用水提法制备不同配伍比例丹参-葛根提取物,体外培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞并建立OGD/R损伤模型,采用CCK-8法筛选最佳配伍比例提取物。采用JADE-PAK?KM-C18（5μm,250×4.6mm）色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱;流速:1 mL/min;进样量:10 μL;柱温:30℃;采集波长:282 nm,分析提取物活性成分。结果:丹参-葛根提取物2:1配伍时SH-SY5Y细胞的存活率最佳,建立的HPLC法可以同时检测丹参-葛根药对中10种成分（丹参素钠、原儿茶醛、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、大豆苷元、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA）。结论:丹参-葛根提取物2:1配伍对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞有较好的保护作用,建立的HPLC法准确、稳定可靠,重复性好,适用于丹参-葛根药对提取物的含量测定。第二部分丹参-葛根提取物对氧糖剥夺/复氧损伤SH-SY5Y细胞的保护作用目的:选取经典的氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤模型,基于氧化应激和凋亡探究丹参-葛根提取物对SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用。方法:将SH-SY5Y细胞分为正常对照组、OGD/R组和丹参-葛根2:1提取物（DG）低、中、高剂量（10、30、100 μg/mL）组,除正常组外,其余各组细胞在氧糖剥夺4 h后迅速复糖复氧12 h进行OGD/R造模。采用CCK-8法检测细胞存活率,显微条件下观察细胞形态,分光光度计法检测乳酸脱氢酶（LDH）释放率、超氧化物歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽（GSH）水平和丙二醛（MDA）含量,2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针法（DCFH-DA）检测细胞活性氧（ROS）水平,JC-1法检测线粒体膜电位,Hoechst 33342染色法观察细胞核形态,流式细胞术结合Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡。结果:与空白对照组相比,OGD/R组细胞形态破损,细胞上清液LDH释放率、细胞ROS水平和MDA含量显著升高（P＜0.01）,SOD活力和GSH水平显著降低（P＜0.01）,线粒体膜电位下降,细胞凋亡率升高（P＜0.01）;与OGD/R组相比,DG提取物各给药组可呈浓度依赖性地提高细胞存活率,改善细胞形态,降低细胞上清液LDH释放率（P＜0.01）;DG提取物30和100 μg/mL组可显著性降低细胞内ROS水平,显著性提高细胞中SOD活力和GSH水平（P＜0.05,P＜0.01）,100 μg/mL可显著降低细胞内MDA含量（P＜0.05）;此外,丹参-葛根提取物给药后可提高线粒体膜电位,30和100 μg/mL可显著降低细胞凋亡率（P＜0.01）。结论:丹参-葛根提取物2:1配伍对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的有较好的保护作用,能够降低细胞氧化损伤,抑制细胞凋亡。第三部分丹参-葛根提取物对脑缺血再灌注损伤大鼠的体内药效评价目的采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型,探究丹参-葛根提取物在正常条件下和高脂病变条件下对MCAO模型大鼠的保护作用。方法采用健康雄性SD大鼠,体重200 g-220 g,随机分为sham组、model组、丹参提取物（DS）200 mg/kg组、葛根提取物（GG）200 mg/kg组和丹参-葛根2:1提取物（DG）200 mg/kg组,比较各给药组抗脑缺血作用的差异;随后进行DG提取物的剂量探索实验,SD大鼠随机分为sham组、model组、丹葛提取物50、100、200 mg/kg组和阳性药丁苯酞（NBP）50 mg/kg组。上述两部分实验中,各组大鼠预先灌胃给药7d,然后采用线栓法建立MCAO模型,缺血2 h后再灌注,假手术组大鼠不插线栓,分别在再灌注后24 h评估改良神经功能缺损评分（mNSS）,检测脑部血流量,并取脑进行TTC染色确定脑梗死体积百分比。同时,检测大鼠血清中氧化应激指标（超氧化物歧化酶、丙二醛、总抗氧化能力和谷胱甘肽过氧化物酶）的变化以及炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP）含量的变化。此外,结合缺血性脑卒中的高危因素,进一步建立了高脂合并脑缺血模型,采用健康雄性SD大鼠,体重120 g-140 g,随机分为sham组、高脂组（H）、高脂合并脑缺血组（HM）和丹参-葛根提取物200 mg/kg组。除sham组外,各组大鼠饲喂高脂饲料28 d,确认大鼠血脂发生改变后,预先灌胃给药7 d,然后采用线栓法建立MCAO模型,缺血2 h后拔出栓线实现再灌注,假手术组大鼠不插线栓,分别在再灌注后24 h评估上述指标的改变。结果与model组相比,DS提取物、GG提取物和DG提取物200 mg/kg均可显著降低MCAO大鼠的脑梗死体积（P＜0.01）,其中DG 200 mg/kg给药组大鼠的脑梗死体积百分比最低,DS和DG组200 mg/kg可降低MCAO大鼠神经功能评分和半球肿胀度（P＜0.01,P＜0.05）,GG组则无显著影响;与模型组相比,DG 50、100、200 mg/kg和NBP 50 mg/kg组可明显降低MCAO大鼠脑梗死体积百分比（P＜0.01）并改善脑血流量（P＜0.01）,DG 100、200 mg/kg和NBP 50 mg/kg组可明显降低MACO大鼠半球肿胀度（P＜0.01）。同时,高脂合并脑缺血组在一定程度上能够加重大鼠的氧化应激和炎症反应。相较于HM组,DG 200 mg/kg给药可显著性降低HM组大鼠的脑梗死体积百分比、半球肿胀度和神经功能评分（P＜0.05）。此外,DG给药能够显著改善脑缺血再灌注大鼠MDA、SOD、T-AOC和GSH-Px水平以及炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP）含量。结论丹参-葛根提取物对脑缺血再灌注大鼠有良好的保护作用,在正常条件下和高脂病变条件下均能够降低脑缺血再灌注大鼠的组织学损伤、改善脑血流并促进神经功能恢复,同时调节脑缺血再灌注后氧化应激,降低炎症因子水平。第四部分丹参-葛根提取物改善脑缺血再灌注损伤大鼠的作用机制探讨目的运用网络药理学技术预测丹参-葛根药对保护缺血性脑卒中可能的作用靶点和信号通路,并用western blot技术对其中的JAK2-STAT3和HIF-1α通路进行验证,初步探讨丹参-葛根药对改善缺血性脑卒中可能的作用机制。方法根据TCMSP数据库获得丹参-葛根的活性成分和潜在靶点,在Uniprot数据库将蛋白名称转化为基因名。利用GeneCards、OMIM、DisGeNet、TTD和DrugBank数据库收集缺血性脑卒中疾病相关靶点,获取丹参-葛根潜在靶点与疾病靶点交集,将网络数据导入Cytoscape 3.8.0软件,绘制药对成分-疾病靶点网络拓扑图。将合集导入STRING网站在线预测各基因间的相互联系,并绘制蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图,利用cytoscape3.8.0构建PPI网络图,筛选核心靶点。最后,对合集靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。根据包含靶点数量筛选排名前20的抗脑缺血通路,构建靶点-通路网络拓扑图。进一步采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记（TUNEL）法检测缺血半暗带细胞凋亡情况,利用western blot技术检测JAK2-STAT3和HIF-1α信号通路和凋亡相关的关键蛋白,利用免疫组织化学技术检测GFAP和IBA1水平。结果筛选出10个丹参-葛根药对保护缺血性脑卒中可能的核心靶点,凋亡、JAK-STAT和HIF-1通路富集性较高。TUNEL实验结果显示,与model组相比,DG 200 mg/kg能显著性降低大鼠脑组织细胞凋亡率。western blot结果显示,与model组相比,DG 200 mg/kg能显著性降低MCAO大鼠脑组织中JAK2和STAT3磷酸化水平（P＜0.05;P＜0.01）,能显著性降低HIF-1α水平（P＜0.01）,显著性下调Bax表达（P＜0.05）,并上调Bcl-2表达（P＜0.05）。免疫组化结果显示,与model组相比,DG200 mg/kg能够显著性抑制MCAO大鼠脑组织中GFAP和IBA1表达（P＜0.05）。结论丹参-葛根药对可能通过抑制JAK2-STAT3通路磷酸化和抑制HIF-1α而抑制细胞凋亡,并调节炎症反应,发挥抗缺血性脑卒中作用。