类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是以慢性滑膜炎、进行性骨质破坏和关节功能丧失为特征的自身免疫性疾病,因其高致残率和脏器受累而严重威胁人类健康。RA的主要炎症部位是关节滑膜衬里层、关节囊和腱鞘,早期学者们即认识到RA与其他器官特异性的自身免疫疾病不同,RA初期并不会引起细胞死亡和组织破坏,而是以病变部位间质组织的活化和增殖为主要特征,随后流行病学研究发现RA的易感性和某些特定的MHC-II分子相关,因此提出了MHC分子所限制的靶向滑膜的CD4~+T细胞反应导致了持续的滑膜炎症这一假说,并在免疫遗传学和动物模型的研究中得到了证实。数十年来,有关滑膜CD4~+T细胞的研究不断深入:滑膜CD4~+T细胞被自身抗原或细胞因子刺激活化后[2],分化为不同的功能亚群,如促炎性的Th1、Th17细胞;抑炎性的调节性T细胞(但在RA中功能缺陷)等;这些CD4~+T细胞与单核细胞、滑膜细胞通过细胞因子和直接接触相互作用,形成复杂的功能网络,释放IL-1、TNF-α、IL-17等促炎性细胞因子,引起滑膜细胞增殖和骨质破坏。因此,慢性活化的滑膜T细胞被认为是RA关节炎的触发因素和慢性化因素,是诱发并加重RA滑膜炎症的中心环节。根据上述研究,RA中CD4~+T细胞的活化、分化和功能均呈现出异常的特点,因此被认为在RA的炎症过程的初始阶段和进展阶段均发挥了重要作用,与其它自身免疫性CD4~+T细胞相比,RA滑膜CD4~+T细胞功能呈现出对丝裂原或回顾抗原的刺激的低反应性、凋亡减少等特点,现有研究分析其可能原因是滑膜炎症微环境因素导致CD4~+T细胞某些胞内调控蛋白的表达异常,可能改变了滑膜CD4~+T细胞功能,并直接影响到RA的炎症进程。因此探索特定微环境作用下的胞内蛋白调控机制具有重要意义。microRNA(miRNA)是新近发现的能够精细调控细胞功能的小分子,通过降解靶mRNA和抑制翻译两种方式精细的、定量的调节生物体内的基因表达。现有研究已证实,T细胞上有多种miRNA的表达,并且miRNA参与调控了T细胞中的发育、成熟、分化及功能等各个生命环节如T细胞的发育、成熟、活化、分化等各个环节。在RA滑膜组织和银屑病皮损中也发现了异常表达miRNA。那么在RA中,是否有miRNA参与了调控CD4~+T细胞的异常功能呢,这种调控最终在RA的炎症中又发挥了什么样的作用?基于此,我们采用miRNA芯片技术和定量PCR技术,筛选并鉴定了RA患者CD4~+ T细胞上异常表达的4个miRNAs,分别是在RA外周血和关节积液CD4~+ T细胞中均上调的has-miR-146a;在RA外周血和关节积液CD4~+ T细胞中均下调的has-miR-363;在RA关节积液CD4~+ T细胞中下调的has-miR-498;以及在RA病人外周血CD4~+ T细胞中表达较关节积液CD4~+ T细胞中表达增加has-miR-150。为了进一步分析这些miRNA与RA炎症的关系,我们同时检测了RA病人关节积液和血清中的TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10的表达水平,通过相关性统计分析,我们发现在关节积液中和外周血中,has-miR-146a与TNF-α均呈显著正相关;而RA患者关节局部存在着高浓度的TNF-α,因此我们推测炎症微环境可能刺激了has-miR-146a的高表达,并进一步通过试验证实RA病人的关节积液能够刺激Jurkat细胞和正常人外周血CD4~+T细胞中has-miR-146a的表达上调,而且不同浓度的TNF-α也能够诱导Jurkat细胞和正常人外周血CD4~+T细胞中miR-146a的表达增加,并呈线性量效关系。根据这些试验结果,我们推测has-miR-146a可能直接参与了RA病人中CD4~+T细胞的功能变化,为了探讨has-miR-146a的功能和作用靶标,我们以高表达has-miR-146a的Jurkat细胞作为研究对象,应用生物信息学方法(MIRANDA、TARGETSCAN、PICTAR三种软件)进行了预测,结合Western blot分析,鉴定出TRAF6是miR-146a在CD4~+ T细胞中的作用靶点之一;然而进一步的功能研究却未发现has-miR-146a对Jurkat细胞的增殖、活化和凋亡有明显影响。为了在体研究has-miR-146a的功能,我们构建了基于慢病毒载体的转基因小鼠,并通过PCR、荧光显微镜、流式细胞技术和定量PCR等多种方法证实了has-miR-146a的转基因小鼠的构建成功;对转基因小鼠的初步的解剖学和病理学观察发现:胸腔内大量血凝块;肝脏增大;病理学观察发现肺间隔略增宽,可见淋巴细胞浸润;脾脏可见大量的多核巨细胞;肾小球可见少量的淋巴细胞浸润,提示慢性多系统炎症的可能;在转基因小鼠的T细胞表型的初步研究中,我们发现has-miR-146a转基因小鼠的CD4~+ T细胞和CD8~+ T细胞的比例无明显变化,Treg、早期活化的CD4~+ CD69~+T细胞和CD8~+ CD69~+T细胞的表达频率也无明显改变;但在转基因小鼠脾脏T细胞中,中央记忆性T细胞比例明显增加;在转基因小鼠外周血T细胞中,效应记忆性T细胞比例明显增加,提示转基因小鼠T细胞处于易于活化的状态;最后在转基因小鼠的DC细胞功能研究我们发现,骨髓来源的DC细胞比例无变化,在LPS刺激成熟后其表达的CD86和MHCⅡ的表达也没有改变,提示高表达has-miR-146a可能不影响DC细胞的成熟。上述有关转基因小鼠的功能研究结果与T细胞特异性敲除TRAF6小鼠的所表现出的多器官慢性炎症和T细胞表型变化类似。根据研究结果发现,我们推测has-miR-146a通过抑制TRAF6的蛋白表达,可能最终参与了CD4~+ T细胞功能异常的形成过程。然而这种功能异常表现在哪些方面,最终对RA的炎症过程有何影响,还需要深入探讨。本研究结果对于深入理解CD4~+ T细胞的胞内调控机制和RA的炎症过程提供了新的线索。