【摘 要】
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菠菜（Spinacia oleracea L.）是一种广泛种植的重要绿叶蔬菜作物。与大多数作物一样,菠菜的生产受到病虫害和杂草等生物胁迫以及盐分、干旱和高温等非生物胁迫的阻碍。目前,菠菜育种的主要目标是选育具有强抗病性（特别是抗霜霉病）、非生物胁迫耐受性、耐抽薹以及高产量和品质的优质种质资源。霜霉病（Downy mildew）病原体可以引发叶斑、茎溃疡、果实或根腐病以及块茎疮痂病,对农作物生产具有
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菠菜（Spinacia oleracea L.）是一种广泛种植的重要绿叶蔬菜作物。与大多数作物一样,菠菜的生产受到病虫害和杂草等生物胁迫以及盐分、干旱和高温等非生物胁迫的阻碍。目前,菠菜育种的主要目标是选育具有强抗病性（特别是抗霜霉病）、非生物胁迫耐受性、耐抽薹以及高产量和品质的优质种质资源。霜霉病（Downy mildew）病原体可以引发叶斑、茎溃疡、果实或根腐病以及块茎疮痂病,对农作物生产具有很大的负面影响。本文研究了菠菜霜霉病病原菌侵染特性,探究确立菠菜霜霉病病原菌培养分离与定量检测体系,以本实验室最新菠菜基因组信息为基础,通过生物信息学方法筛选鉴定菠菜NBS-LRR蛋白家族成员,结合全基因组关联分析（GWAS）对菠菜霜霉病抗性关键候选基因克隆测序,研究候选基因在不同菠菜的抗感材料和部位的组织表达谱,并结合病原菌侵染检测探究病害时间段的精确表达变化,对菠菜种质资源进行霜霉病抗性重鉴定与营养品质指标测定分析,以期为菠菜霜霉病抗病育种提供有力参考。主要研究结果如下:1.病原菌离体培养固体培养基获得乳白色液体菌落和灰色丝状菌落,液体培养基培养结果乳白色液体菌落生长在培养基底部而灰色丝状菌落生长在培养基液面。对霜霉病病原菌候选序列cox2和rps10克隆测序,设计PCR定量检测引物,定量检测灵敏度DNA浓度为10-2ng/μL;同浓度霜霉病病原菌DNA、菠菜感病材料和抗病材料DNA特异性检验引物对病原菌DNA特异;由病原菌目的序列质粒浓度梯度扩增结果,以不同稀释梯度的含有菠菜霜霉病病原菌序列质粒拷贝数对数为x轴、绝对定量结果CT值为y轴构建标准曲线,二者线性关系良好（y=-3.36x+11.81）,相关系数R~2=0.9949,斜率为-3.36,截距为11.81;特异引物检测结果扩增效率cox2斜率为3.36相较rps10斜率2.87较好;目的序列cox2引物对接种叶片进行病原菌定量检测,第9 d可检测到病原菌,第9 d扩增CT值为19.58,菠菜霜霉病病原菌于接种后第9 d发病可检测到病原菌拷贝数为9.86×10~4 Copies/μL,第9 d相较于其它检测结果都有显著差异,第10～14 d病原菌拷贝数相对在区间范围内波动。2.通过生物信息学方法筛选鉴定114个菠菜NBS-LRR家族成员,对染色体定位信息、理化性质、系统进化关系、保守基序、保守结构域、基因结构和多序列比对进行系统全面鉴定分析;结合GWAS选择了菠菜霜霉病抗性候选区域3个菠菜NBS-LRR基因和2个NBS-LRR特殊结构域基因和5个进化树不同结构域分支基因共10个相关候选基因研究了其在菠菜不同组织、不同菠菜霜霉病抗感材料和性状部位的表达情况,同时研究了在菠菜霜霉病感病材料（sp73）和抗病材料（whale）做霜霉病处理后的基因表达变化,预测了菠菜NBS-LRR家族成员之间的相互作用网络。3.结合4个GWAS候选基因分析,克隆测序结果中3个序列存在插入段和多个突变点;并选取33个GWAS候选基因在8个菠菜抗感材料进行种质资源差异表达分析,关键候选基因在接种病原菌后均在感病材料（sp73）第5 d和第9d存在明显拐点峰值,抗病材料（whale）中第9 d存在变化峰值,第9 d是菠菜霜霉病抗性特异变化时间点。4.对菠菜霜霉病种质资源筛选鉴定,大棚内199份菠菜材料田间自然发病鉴定出162份高抗材料,占比81.41%;6份中抗材料,占比3.02%;26份抗病材料,占比13.07%;5份感病材料,占比2.51%;玻璃温室内种植的190份菠菜材料人工接种鉴定出136份感病材料,占比71.58%;8份高抗材料,占比4.21%;39份抗病材料,占比20.53%;1份中抗材料,占比0.53%;6份高感材料,占比3.16%;对玻璃温室鉴定出的48份菠菜抗病材料进行室内侵染重鉴定,室内鉴定结果其全是高抗材料。5.筛选室外玻璃棚主流接种鉴定20份霜霉病抗性和感病材料测定营养品质指标草酸、硝态氮、可溶性糖、可溶性蛋白、VC及β胡萝卜素含量情况,各筛选材料营养品质含量各异;结合改进侵染接种策略及绝对定量检测结果在0 d、9 d、14 d对感病材料sp73和抗病材料whale叶片进行营养品质含量测定分析,测定结果各营养品质指标在抗感材料中有不同变化特性。
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