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随着养猪业的规模化、专业化、集约化管理程度增加,人工授精技术的推广应用越来越广泛。猪人工授精技术对于提高生猪生产、促进优良种公猪利用率及加快遗传育种改良进程具有重要意义。猪人工授精技术使用的精液为15～17~oC条件下保存的液态稀释精液。液态稀释精液的保存效果是制约猪人工授精技术发展的重要因素之一。精子运动的维持依赖于自身的能量供应。糖酵解和氧化磷酸化途径是体细胞广泛存在的重要能量代谢途径。细胞对能量代谢途径的选择取决于其微环境的能量代谢底物类型。精子在精浆和子宫液中做直线运动及在输卵管液中做超活化运动,即精子的代谢参与精子运动的调控。但是精子代谢对精子运动的调节作用及机制尚不清楚。通过探究精子代谢而改良稀释液成份对建立高效的猪精液保存稀释液配方具有重要意义。因此,本研究从精子代谢入手,探究精子氧化磷酸化途径及其相关作用因子在维持精子直线运动中的调控机制。本研究首先利用低糖模型探究糖酵解和氧化磷酸化供能方式对精子运动的影响,并检测精子运动轨迹变化及线粒体的转录翻译。其次,通过低糖稀释液模型及精子线粒体功能分析探究氧化磷酸化副产物活性氧(reactive oxygen species,ROS)对精子运动的损伤机制。此外,通过检测精子的谷胱甘肽合成及磷酸戊糖途径探究精子自身如何维持精子线粒体氧化磷酸化的运转。本研究主要取得如下结果:(1)精子在高糖液稀释液中做圆圈运动或类圆圈运动;降低稀释液中的葡萄糖含量促进猪精子直线运动。低糖稀释液通过激活精子线粒体活性、进而促进线粒体合成ATP(adenosine triphosphate)。精子直线运动的能量来源主要依靠线粒体合成的ATP。(2)猪精子在低糖稀释液的体外孵育过程中,精子存在线粒体基因的转录与翻译。线粒体翻译抑制剂处理结果揭示精子线粒体的转录与翻译参与了精子运动的调控。精子线粒体转录翻译主要通过影响线粒体功能,进而影响线粒体ATP的合成而调控精子的运动。(3)低糖稀释液在促进精子线粒体氧化磷酸化供能的同时也产生大量的副产物ROS,过量的ROS会氧化损伤精子的功能、降低精子的直线运动能力。(4)ROS主要氧化损伤精子线粒体蛋白转录系统及线粒体ATP合成系统。研究发现,随着胞内ROS含量的增加,精子线粒体呼吸链蛋白MT-ND1(NADPH dehydrogenase subunits 1)、MT-ND6(NADPH dehydrogenase subunits 6)和线粒体转录因子POLRMT(mitochondrial RNA polymerase)、TFAM(mitochondrial transcription factor-A)的4-HNE(4-hydroxynonenal)修饰增加,即MT-ND1、MT-ND6、POLRMT和TFAM的氧化损伤增加。并且,精子线粒体DNA也受到ROS的攻击而被氧化损伤。(5)在低糖稀释液中外源添加线粒体靶向抗氧化剂PQQ(pyrroloquinoline quinone)和Co Q10(coenzyme Q10)可以维持精子的直线运动,但是当线粒体翻译被抑制的情况下,添加这两种抗氧化剂均不能挽救精子的运动,说明PQQ和Co Q10不能有效减缓ROS对呼吸链上的蛋白MT-ND1和MT-ND6的氧化损伤。这主要是由于呼吸链上的蛋白更近于ROS产生的位点。PQQ和Co Q10主要通过保护线粒体的转录系统(POLRMT和TFAM)而维持线粒体的转录与翻译,进而为呼吸链上的来源于线粒体转录翻译蛋白(如MT-ND1和MT-ND6等)的周转提供新蛋白,维持线粒体ATP的合成,提高精子的直线运动。(6)猪精浆中存在合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)的氨基酸底物,其中蛋氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸含量较高,半胱氨酸含量较低。在低糖稀释液中添加蛋氨酸、甘氨酸、谷氨酸及丝氨酸可以促进精子合成GSH,并缓解精子的氧化损伤而维持精子的直线运动。猪精子存在利用蛋氨酸合成GSH的途径,精子存在由蛋氨酸合成GSH途径所涉及的蛋白酶CBS(cystathionine beta synthase)、CTH(cystathionase)、GCLC(glutamate-cysteine ligase)和GSS(glutathione synthetase);并且蛋白酶CBS和CTH含量随着精子氧化应激程度的增加而增加,GCLC和GSS蛋白酶含量则未发生显著变化。说明氧化应激可以诱导精子合成CBS和CTH蛋白酶,进而利用蛋氨酸合成GSH而减缓ROS诱导的氧化损伤。(7)氧化应激激活精子的ERK1/2-e IF4E-RSK信号通路。随着精子胞内ROS含量的增加,精子内的p-ERK1/2、p-RSK、p-e IF4E水平增加,这也揭示了精子可以通过自身氧化还原平衡系统减少ROS的氧化损伤。(8)精子的磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)参与精子的直线运动调控。无糖稀释液不能持久维持精子的直线运动,而20%葡萄糖稀释液中则可以持久维持精子直线运动。低糖稀释液中的葡萄糖进入合成NADPH的PPP途径,未进入糖酵解供能途径。精子衣康酸修饰是调节其葡萄糖代谢重编程的关键因子。低糖稀释液可以促进三羧酸循环产生中间代谢产物衣康酸,衣康酸对精子糖酵解途径的ALDOA(aldolase A)酶进行修饰,使其失活,进而降低精子的糖酵解途径,使葡萄糖进入PPP途径,参与NADPH的合成,进而参与自身氧化还原稳态的调控。综上所述,本研究探究了精子代谢对直线运动的调控作用。发现精子直线运动主要受线粒体氧化磷酸化供能调控;氧化磷酸化副产物ROS主要氧化损伤精子线粒体转录翻译系统和能量合成系统;精子自身通过调节谷胱甘肽合成和磷酸戊糖途径而调节其胞内氧化还原平衡稳态,进而维持精子的高速直线运动。本研究发现为高效猪精液保存稀释液的研发提供理论依据,并为高效猪人工授精技术体系的建立奠定基础。