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角质化生长因子(KGF-1)是成纤维母细胞生长因子家族(FGFs)的一员,又名成纤维细胞生长因子7(FGF-7)。其特异性受体FGFR2Ⅲb仅表达于各种上皮细胞,所以KGF-1仅特异作用于上皮细胞。这一特性使得KGF-1蛋白药物在给药时定向性更好,同时也更加安全。2004年,美国AMGEN公司研发的帕利夫明注射液(即Kepivance)通过FDA批准上市,适应症为治疗恶性血液病患者的严重口腔黏膜炎。KGF-1的潜在应用价值还还有治疗由于代谢疾病引起的慢性伤口愈合、早产儿表面活性剂的不足与支气管肺发育不良、急性肺损伤、急性肝损伤的治疗等。虽然KGF-1蛋白在医学上有着很大的应用潜力,但是目前对于重组KGF-1蛋白表达的研究仍在处于探索阶段。KGF-1蛋白已经在大肠杆菌、CHO细胞及植物细胞等表达系统中进行过表达,结果都并不令人十分满意。SUMO是一种类泛素蛋白,结构与泛素蛋白十分相似。与泛素化不同的是,生物体内蛋白的sumo化(sumoylation)反应可以加强靶蛋白的稳定性、帮助靶蛋白正确转运和折叠、影响蛋白质的转录活性。近年来,SUMO蛋白融合标签被越来越多的运用于表达一些过去难以表达的蛋白质,显著提高了这些蛋白的表达量及可溶性。本研究中,我们应用重叠PCR技术,将poly His-sumo标签基因序列与N端缺失23个氨基酸残基的rhKGF-1基因序列拼接,构建融合基因6His-sumo-rhKGF1。将融合基因与非融合基因分别克隆至表达载体pET30a和pJW2上,构建重组表达载体。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,筛选表达量最高的重组表达质粒。对得到的阳性重组表达质粒进行密码子优化,同时尝试通过改变诱导条件来提高蛋白表达量。工程菌经诱导表达之后,进行超声破碎处理,离心后,取上清经镍柱纯化。收集纯化得到的融合蛋白,SUMO Protease处理切除SUMO标签,再经镍柱纯化获得rhKGF-1蛋白。利用人永生化表皮细胞(HaCat细胞)模型,经CCK-8显色,检测rhKGF-1的生物活性。通过对上述内容的研究,得到以下结果：1.重组表达质粒pET30a-rhKGF-1、pET30a-6His-sumo-rhKGF-1、pJW2-rhKGF-1、pJW2-6His-sumo-rhKGF-1经双酶切鉴定和测序验证证明成功构建。通过诱导表达,筛选出阳性表达载体pET30a-6His-sumo-rhKGF-1。2.对融合基因进行了密码子优化,摸索了诱导表达的三个因素的条件,均未能提高融合蛋白的表达量。3.经SDS-PAGE电泳分析,重组融合蛋白大部分都存在于细菌破碎后的上清里,从4L菌液中得到约8mg可溶性表达的融合蛋白。4.用SUMO蛋白酶酶切纯化后的融合蛋白,再经镍柱纯化可获得具有生物活性的rhKGF-1蛋白,其具有促进HaCat细胞增殖的作用,EC50=6.11ng/ml。本论文的研究提高了rhKGF-1蛋白在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达,获得了具有生物活性的AN23 KGF-1蛋白,为KGF-1蛋白进一步的制药、制剂提供了实验基础和数据支持。